Visualizzazione degli effetti dei danni ossidativi sulle camere delle uova Drosophila utilizzando l'imaging dal vivo

Summary

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare l'imaging vivo per visualizzare gli effetti dei danni ossidativi sulla localizzazione e dinamica delle strutture subcellulari nelle ovaie di Drosophila.

Abstract

L'imaging dal vivo delle ovaie di Drosophila melanogaster è stato determinante nella comprensione di una varietà di processi cellulari di base durante lo sviluppo, tra cui il movimento delle particelle di ribonucleoproteina, la localizzazione dell'mRNA, il movimento degli organelli e la dinamica citoscheletrica. Esistono diversi metodi per l'imaging dal vivo che sono stati sviluppati. A causa del fatto che ogni metodo prevede la sezionatura di singoli ovariole poste in mezzi o olio di alocarbonio, i danni cellulari dovuti all'ipossia e / o alla manipolazione fisica si verificheranno inevitabilmente nel tempo. Un effetto a valle dell'ipossia è quello di aumentare il danno ossidativo nelle cellule. Lo scopo di questo protocollo è quello di utilizzare l'imaging vivo per visualizzare gli effetti del danno ossidativo sulla localizzazione e la dinamica delle strutture subcellulari nelle ovaie di Drosophila dopo l'induzione di danni cellulari controllati. Qui, usiamo il perossido di idrogeno per indurre danni ossidativi cellulari e dare esempi degli effetti di tali danni su due strutture subcellulari, i mitocondri e le particelle di beatitudine di Clu. Tuttavia, questo metodo è applicabile a qualsiasi struttura subcellulare. I limiti sono che il perossido di idrogeno può essere aggiunto solo ai mezzi acquosi e non funzionerebbe per l'imaging che utilizza olio di alocarbonio. I vantaggi sono che il perossido di idrogeno è prontamente disponibile ed economico, agisce rapidamente, le sue concentrazioni possono essere modulate e il danno ossidativo è una buona approssimazione dei danni causati dall'ipossia e dai danni generali ai tessuti dovuti alla manipolazione.

Introduction

Più stressanti cellulari diversi possono insorgere durante la coltura sperimentale e la manipolazione dei tessuti ex vivo, tra cui shock termico, stress ossidativo, stress osmotico, stress nutrizionale e condizioni di tossicità. L'imaging dal vivo è un potente strumento utilizzato per visualizzare i cambiamenti in tempo reale nei tessuti ex vivo dopo il trattamento sperimentale e la manipolazione. Le dissezioni e la manipolazione dei tessuti fini prendono pratica e la quantità di tempo dalla dissezione all'imaging può variare a seconda dell'esperienza. La logica per lo sviluppo di questo metodo si basa sulla preoccupazione che la preparazione del tessuto per l'imaging vivo possa causare stress cellulare durante la dissezione e la preparazione dell'imaging. Ciò potrebbe essere particolarmente problematico per i processi sensibili ai cambiamenti nel metabolismo cellulare e ai livelli di ossigeno disponibili, come la funzione mitocondriale. Sebbene avere un campione parallelo di tipo selvatico sia un controllo importante, c'è ancora la possibilità che alcuni o tutti i cambiamenti osservati nelle strutture subcellulari possano essere dovuti a danni o stress cellulare dalla dissezione e non riflettano la fisiologia normale o il trattamento o la mutazione in fase di studio.

Per affrontare questo potenziale problema, utilizziamo l'aggiunta di perossido di idrogeno durante l'imaging dal vivo al fine di indurre danni ossidativi^{cellulari 1}. Lo scopo di questo metodo è quello di indurre danni ai tessuti al fine di monitorare l'effetto sulle strutture subcellulari. Questo protocollo è utile per due scopi: 1) determinare se i cambiamenti nella localizzazione subcellulare della struttura di interesse sono dovuti allo stress causato dalla dissezione inesperta e 2) una volta che il ricercatore è fiducioso con le tecniche di dissezione descritte per monitorare l'effetto dello stress controllato sulla struttura di interesse. Qui mostriamo due esempi di come l'aumento dei danni ossidativi causi cambiamenti in due strutture subcellulari, i mitocondri e le particelle di beatitudine di Clu. Per fare questo, usiamo l'ovaio Drosophila che è un modello comune per gli studi di imaging dal vivo. Il primo esempio esamina la localizzazione mitocondriale. Nella nostra esperienza, la normale localizzazione mitocondriale nelle cellule germinali femminili è altamente sensibile alle perturbazioni e può agire come un presagio dello stress cellulare. I mitocondri nelle cellule germinali femminili di Drosophila sono normalmente dispersi uniformemente in tutto il citoplasma². L'aggiunta di perossido di idrogeno fa sì che gli organelli localizzino e si ammalino rapidamente in modo simile a varie^{mutazioni 3,4,5}. Il secondo esempio sono le particelle di beatitudine formate da Clueless (Clu). Clu è una ribonucleoproteina diffusa in tutto il citoplasma; tuttavia, forma anche particelle associate ai mitocondri in condizioni cellulari ottimali⁵. Poiché la presenza di particelle di Clu dipende da condizioni cellulari sane, le abbiamo definite particelle di "beatitudine"^3,5,6. L'aggiunta di perossido di idrogeno fa sì che queste particelle si disperdono rapidamente e diventino omogenee nel^{citoplasma 5}. Nel corso dei nostri studi, abbiamo osservato cambiamenti nella localizzazione di entrambe queste strutture subcellulari, ma solo dopo aver eseguito studi di imaging dal vivo potremmo apprezzare appieno l'effetto dello stress cellulare e dei danni ossidativi sulla localizzazione e sulla dinamica dei mitocondri e delle particelle di beatitudine.

L'utilità di questo protocollo come aggiunta a metodi già stabiliti o alternativi dipende da diversi fattori. In primo luogo, il protocollo di imaging deve essere suscettibile di aggiunta di farmaci. Se il campione è montato sotto un coverslip e in olio di alocarbonio, questo metodo non sarebbe possibile⁷. L'aggiunta di H₂O₂ provoca un rapido aumento dei danni ossidativi, pertanto questo lassorario potrebbe non essere appropriato. Il danno ossidativo può essere considerato una procura per l'ipossia; tuttavia, potrebbe essere troppo duro o troppo generalizzato per funzionare come un controllo appropriato per i danni per alcuni componenti subcellulari. Infine, per gli esperimenti di imaging che durano ore come quelli che seguono un processo di sviluppo,_l'addizionedi H 2 O 2 può essere_troppo forte^{(ad esempio 8}). Testare una curva di concentrazione può superare questa limitazione.

Protocol

1. Preparazione della dissezione e dei mezzi di imaging

NOTA: I supporti più adatti a questo esperimento di imaging dal vivo contengono il supporto Drosophila di Schneider contenente il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6x Pen-Strep e 200 μg/mL di insulina bovina, di seguito denominata supporto di Complete Schneider.

1. Eseguire la preparazione del supporto in condizioni sterili per assicurarsi che non sia contaminato. Il supporto è stato sviluppato per supportare Drosophila ovarioles per lunghi periodi di tempo⁹.
2. Aggiungere il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6x Pen-Strep e 200 μg/mL di insulina bovina al supporto schneider.
3. Mescolare bene il contenuto e conservare a 4 °C durante la notte.
   NOTA: L'insulina non si dissolve completamente nel supporto di Schneider completo e noterai un precipitato che si deposita nella parte inferiore del tubo.
4. Fare aliquote del supporto, assicurandosi di lasciare il precipitato in quanto interferirà con l'imaging.
   NOTA: Questa soluzione può essere utilizzata entro un mese se conservata in aliquote a 4 °C.

2. Raccolta di Drosophila per la dissezione

NOTA: Le procedure dettagliate di raccolta e dissezione della Drosophila si trovano anchein Weil et^al.

1. Per un'imaging ottimale delle cellule germinali femminili, preparare prima una fiala contenente cibo di mosca di farina di mais standard e un tampone di pasta di lievito umido che è la consistenza del burro di arachidi. Ciò garantisce che le mosche femminili siano ben nutrite e producano tutte le fasi di sviluppo del follicolo per l'imaging.
2. Per mosche ottimali e sane, raccogli femmine vecchie di 0-1 giorno e trasferisci con i maschi in una fiala di cibo a mosca contenente pasta di lievito umido.
   NOTA: Assicurarsi che le mosche addormentate non contattino la pasta di lievito in quanto possono attaccarsi ad essa.
3. Nutrire le mosche 3-7 giorni, cambiando quotidianamente il flaconcino e la pasta di lievito.
   NOTA: Assicurarsi che la pasta di lievito contatti il fly food in modo che non si asciughi.

3. Dissezione dell'ovaio Drosophila

NOTA: È importante preparare le soluzioni multimediali fresche perché il perossido di idrogeno è suscettibile all'ossidazione e TMRE si degrada nel tempo.

1. Poco prima della dissezione, nel supporto di Schneider completo, preparare una nuova aliquota di 2 μM H₂O_{2 soluzione,} un'aliquota fresca di 46 nM tetrametillrhodamina, estere etilico (TMRE) e una nuova aliquota di una soluzione TMRE da 46 nM contenente 2 μM H₂O_2.
2. Per la dissezione dell'ovaio, utilizzare due paia di pinza fine e un paio di aghi di tungsteno affilati elettroliticamente¹². Per sezionare le ovaie, riempire 2-3 pozzali di un piatto di sezionatura del fondo di vetro (vetro da orologio) con Schneider completo che è stato riscaldato a temperatura ambiente.
3. Anestetizza la fiala delle mosche ingrassate con anidride carbonica e segrega il numero desiderato di mosche femminili da sezionare. Posizionare una singola mosca nel supporto utilizzando le forcep.
4. Al microscopio sezionato, afferrare delicatamente la mosca dal torace usando un paio di forcep fini. Con l'altra coppia di forcep, afferrare il posteriore e tirare delicatamente per rimuovere le ovaie.
   NOTA: se le ovaie non escono senza intoppi usando questo metodo, l'intero addome può anche essere rimosso dalla mosca e le ovaie possono essere delicatamente spremute da entrambe le estremità dell'addome usando le forcep.
5. Rimuovere qualsiasi cuticola o tessuto estraneo, quindi trasferire le ovaie in un nuovo pozzo contenente mezzi freschi. Le ovaie dovrebbero ancora muoversi dalla torcia muscolare circostante.

4. Preparazione degli ovariole per l'imaging

1. Utilizzando aghi di tungsteno affilati, prendere delicatamente in giro gli ovarioli a parte, facendo attenzione a rimuovere la torcia muscolare circostante (Figura 1).
2. Prendere delicatamente in giro qualsiasi falesia muscolare e fibre nervose attaccate alle ovaiole isolate (Figura 2).
   NOTA: Se la chiave muscolare non viene rimossa, l'ovariolo si contrae e si muove, causando problemi con l'acquisizione dell'immagine (Video 1).
3. Se le strutture subcellulari di interesse sono etichettate in modo endogeno, procedere al passaggio 4.4. Se le strutture di interesse saranno etichettate con un colorante fluorescente, procedere alla sezione 5.
4. Una volta che gli ovariole sono stati sezionati in modo pulito, utilizzando una micropipetta, trasferirli in una goccia di 100 μL del supporto di imaging di Complete Schneider nella depressione del vetro di un piatto inferiore di vetro. Le singole ovaiole affonderanno sul fondo della goccia.
5. Procedere alla sezione 6 per l'imaging.
   NOTA: Per l'imaging di mitocondri e particelle di beatitudine Clu, non devono trascorrere più di cinque-dieci minuti dall'inizio della dissezione all'imaging.

5. Colorazione dei mitocondri con TMRE

NOTA: Ulteriori procedure dettagliate sulla colorazione in diretta dei mitocondri con coloranti fluorescenti possono essere trovate in Parker et al.

1. Dopo il passaggio 4.3, trasferire gli ovarioli isolati in una goccia di 100 μL di 46 nM TMRE media nella depressione del vetro di un piatto inferiore di vetro. Le singole ovaiole affonderanno sul fondo della goccia.
2. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Posizionare il coperchio sul piatto con fondo di vetro e posizionare il piatto in una scatola coperta per tutta la durata dell'esperimento per proteggersi dalla luce.
   NOTA: Dopo l'incubazione, i campioni possono essere immagini direttamente senza lavaggi.
3. Ripetere i passaggi 5.1-5.2 per preparare almeno due piatti di ovariole etichettate TMRE, uno per servire come gruppo sperimentale e uno per fungere da controllo.

6. Acquisizione di immagini dal vivo

1. Una volta montati gli ovariole, posizionare una delle stoviglie inferiori in vetro sul microscopio e configurare i parametri di imaging in base alle esigenze. Le lunghezze d'onda ottimali di eccitazione/emissione per il TMRE qui utilizzato sono di 549 nm/574 nm.
2. Dopo aver individuato il campo visivo desiderato, acquisire immagini fisse o brevi video di uno o più ovarioli come desiderato come record di condizioni di pre-trattamento.

7. Aggiunta di perossido di idrogeno durante l'imaging

1. Sospendere l'imaging dal vivo, rimuovere il coperchio dal piatto inferiore di vetro e aggiungere con cura 100 μL di 2 μM H₂O_{2 soluzione} al piatto utilizzando una micropipetta se si imaging strutture etichettate in modo endogeno. Se si imaging mitocondri, aggiungere con cura 100 μL di 46 nM TMRE con soluzione 2 μM H₂O₂ al piatto utilizzando una micropipetta (Video 2).
   1. Evitare di rompere la superficie della goccia multimediale esistente o di aggiungere lasoluzione tropporapidamente in modo da non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo del piatto ( Video 2 ).
2. Sostituire il coperchio del piatto (coperchio del piatto), spostare e rifocalizzare il campo visivo desiderato, se necessario, e riprendere l'imaging (Video 3, Video 4, Figura 3, Figura 4).
   1. Fare attenzione a riprendere l'imaging il più rapidamente possibile dopo l'aggiunta di H₂O₂ in quanto il trattamento sperimentale è sensibile al tempo (Video 5).
3. Acquisire immagini fisse o brevi video di uno o più ovariole come desiderato. Ciò servirà come registrazione delle condizioni post-trattamento.
4. Per il controllo, posizionare il secondo piatto inferiore in vetro sul microscopio e ripetere la sezione 6.
5. Ripetere il passaggio 7.1, questa volta aggiungendo 100 μL di supporti solo TMRE al piatto. Se si imaging di strutture etichettate in modo endogeno, aggiungere 100 μL della soluzione di sola supporto di Schneider complete.
6. Ripetere i passaggi 7.2 e 7.3 per acquisire i dati per il gruppo di controllo.
   NOTA: Per l'imaging di mitocondri e particelle di beatitudine di Clu, non devono trascorrere più di tre-cinque minuti dall'aggiunta di perossido di idrogeno all'imaging.

Results

I protocolli descritti possono essere utilizzati per studiare gli effetti del perossido di idrogeno durante l'imaging dal vivo delle ovaie di Drosophila. Come illustrato nella figura 3, Figura 4, Video 3 e Video 4, questa procedura fornisce un mezzo efficace per visualizzare i cambiamenti e le dinamiche dei tessuti dopo il trattamento sperimentale in tempo reale. È importante sottolineare che questo protocollo è specifico per l'aggiunta di H₂O_{2 agli} ovariole durante l'imaging; tuttavia, può essere adattato per l'aggiunta esogena di altri farmaci o reagenti di interesse. Inoltre, i follicoli possono essere etichettati con qualsiasi colorante fluorescente di interesse (ad esempio, tetrametillrhodamina (TMRE), LysoTracker) prima dell'imaging (Video 3). I passaggi più critici per ottenere risultati di imaging chiari sono 1) la corretta dissezione e isolamento di singoli ovarioli con tutti gli elementi contrattili rimossi(Figura 1 e Figura 2) e 2) la velocità con cui l'imaging viene riavviato dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Video 4 è un'illustrazione di un follicolo correttamente sezionato che rimane costante per tutta la durata dell'imaging rispetto al Video 1, che illustra un follicolo scarsamente sezionato che esce dal campo visivo durante l'imaging. Il video 5 è un'illustrazione in cui gli effetti H₂O₂ sui mitocondri con etichetta TMRE sono già progrediti prima dell'inizio dell'imaging a causa di un tempo trascorso troppo. Rispetto al Video 3 in cui l'imaging è stato riavviato subito dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno (tempo 0) e intatti, i mitocondri dispersi sono ancora visibili, i mitocondri nel Video 5 hanno già iniziato a ciuffare visibilmente e perdere il loro potenziale di membrana al riavvio dell'imaging. Questo problema è principalmente attribuito all'interruzione delle posizioni del campione durante l'aggiunta di H₂O₂ e può essere alleviato seguendo la tecnica per mantenere intatti il supporto di imaging e la posizione del campione (Video 2). Da notare, negli esperimenti di controllo eseguiti senza H₂O₂ aggiunto al supporto, i mitocondri nei follicoli rimangono correttamente dispersi e il colorante TMRE rimane sequestrato nei mitocondri.

Figura 1: Isolamento delle singole ovaiole dalle ovaie di Drosophila. (A) Cartone animato che indica un paio di ovaie, un singolo ovariolo (freccia) con il germario sulla punta (punta di freccia) e le due falesie muscolari che circondano l'ovariolo (marrone, epiteliale) e l'ovaio (marrone, peritoneale). (B) Ovaia drosofila sezionata. (C) Successiva separazione dell'ovaio preso in giro in singoli ovarioles (freccia). Barra di scala = 100 um. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rimozione delle fibre nervose e degli elementi contrattili dalle singole ovaiole. (A) Ovariolo singolo con resti di tessuto nervoso e la tora muscolare ancora attaccata (freccia). (B) Rimozione delicata di tutto il tessuto rimanente attaccato all'ovariolo in A (freccia). Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: H₂O₂ causa una delocalizzazione mitocondriale. (A-A")Ala immagini vive di un follicolo clu^CA06604 ben nutrito (moscerini Clu::GFP). L'aggiunta di H₂O₂ fa sì che i mitocondri si aglucino per tutta la durata dell'imaging. L'etichettatura TMRE dei mitocondri indica che i mitocondri sono inizialmente dispersi al tempo 0 (A), e che i mitocondri iniziano a ciuffarsi dopo l'aggiunta di H₂O₂ (A′) In un secondo momento, l'etichettatura TMRE diventa imprevedibile a causa della perdita del potenziale della membrana da parte dei mitocondri e quindi della loro capacità di sequestrere il colorante (A"). Bianco = TMRE (A-A"). Barre di scala: 10 μm in (A) per A-A"⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: H₂O₂ disperde Clu. (A-A") Ala immagini vive di un follicolo clu^CA06604 ben nutrito. L'aggiunta di H₂O_{2 fa} sì che le particelle si disperdono e diventino omogenee nel citoplasma per tutta la durata dell'imaging. Bianco = Clu::GFP (A-A"). Barra di scala: 40 μm in (A) per A-A"⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Follicolo da una femmina clu^CA06604. Come descritto nella figura 2 , la mancatarimozione degli elementi contrattili delle fibre nervose dai singoli ovarioli causerà una marcata deriva e movimento degli ovarioli durante l'imaging e la conseguente incapacità di analizzare i dati di imaging. Bianco = Clu::GFP. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Corretta aggiunta di H₂O_{2 al} piatto campione. Il perossido di idrogeno deve essere aggiunto alla piastra del campione utilizzando una micropipetta di dimensioni appropriata. Erogazione H₂O_{2 senza rompere} la superficie del supporto. Si fa attenzione a evitare di rompere la superficie del supporto di imaging per ridurre al minimo la deriva del campione durante l'aggiunta di perossido di idrogeno. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Aggiunta H₂O_{2 durante} l'imaging di follicoli etichettati TMRE. Follicolo da una femmina clu^CA06604 macchiata di TMRE. H₂O_{2 causa} la delocalizzazione mitocondriale nei follicoli di Drosophila. Bianco = colorante TMRE. Immagine di un fotogramma per 15 s per 20 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo⁵. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Aggiunta H₂O_{2 durante} l'imaging dei follicoli Clu::GFP. Follicolo da una femmina clu^CA06604. H₂O_{2 disperde} le particelle di Clu come descritto nella figura 4. Bianco = Clu::GFP. Immagine di un fotogramma per 15 s per 15 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo. ⁵Clicca qui per scaricare questo video. 

Video 5: Imaging ritardato dopo l'aggiuntadi H₂O_2. Follicolo da una femmina clu^CA06604. L'aggiunta di idrogeno-perossido ai follicoli è un trattamento sensibile al tempo. Il riavvio dell'imaging è stato ritardato in questo video a causa dello spostamento del campione durante l'aggiunta di H₂O_2. I mitocondri hanno già iniziato a ciuffare visibilmente e a perdere il loro potenziale di membrana al riavvio dell'imaging al tempo 0 (rispetto al tempo 0 nel Video 3). La mancata ripresa rapida dell'imaging dopo il trattamento comporterà risultati imprecisi e inutilizzabili, poiché i primi effetti sperimentali verranno persi prima dell'imaging. Bianco = TMRE. Immagine di un fotogramma per 15 s per 20 minuti e il video è di 10 fotogrammi al secondo. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussion

Questo protocollo potrebbe essere un'utile aggiunta come controllo per gli artefatti a causa della dissezione dell'ovaio e dell'incubazione tissutale per qualsiasi esperimento di imaging dal vivo. I passaggi critici sono simili a quelli trovati per altri protocolli di imaging dal vivo. Imparare a sezionare intere ovaie di Drosophila richiede pratica; tuttavia, questa abilità può di solito essere appresa abbastanza rapidamente con gli strumenti di dissezione appropriati. Più difficile da padroneggiare è rimuovere il muscolo avvolgente le ovaie e ogni ovariolo¹³. Questo deve essere fatto per garantire che le contrazioni muscolari non interferiscano con l'acquisizione di immagini. Se l'uso di aghi di tungsteno affilati per fare questo non si rivela un successo, il germario sulla punta dell'ovariolo può essere afferrato con pinza e l'ovariolo estratto dalla toria muscolare. Tuttavia, questa tecnica è problematica se si vogliono esaminare le prime fasi di sviluppo perché possono danneggiarsi. Un altro passo fondamentale è quello di non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo del piatto quando si aggiunge H₂O₂. Un ulteriore aspetto importante è condiviso da tutte le immagini dal vivo: il ricercatore dovrebbe garantire che la struttura di interesse sia fluorescentmente ben etichettata prima del trattamento. I piatti qui utilizzati(Table of Materials) sonocomunemente usati per l'imaging dal vivo; tuttavia, qualsiasi piatto o scivolo con una coverlip di vetro sul fondo o anche una grande coverlip di vetro dovrebbe funzionare purché la goccia di supporto possa essere coperta per evitare l'evaporazione del mezzo. Mentre usiamo un particolare microscopio, qualsiasi microscopio invertito con un obiettivo di ingrandimento sufficiente per vedere la struttura subcellulare in questione e una fotocamera collegata che ha una risoluzione e una velocità di acquisizione dell'immagine sufficienti dovrebbe funzionare.

Mentre il nostro laboratorio è principalmente interessato alla funzione mitocondriale, questo metodo potrebbe essere utile esaminando la dinamica e la localizzazione di qualsiasi struttura subcellulare o organelli, come il nucleo, il citoscheletro o il reticolo endoplasmatico. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti. Per aggiungere perossido di idrogeno, il tessuto deve essere in un supporto acquoso. Un metodo alternativo per l'imaging dal vivo è quello di utilizzare l'olio di alocarbonio, che è stato determinante nel descrivere molti processi importanti nelle ovariole di Drosophila tra cui il primo esempio di movimento dinamico della GFP in un organismo^{modello 7,14}. Inoltre, l'aggiunta di perossido di idrogeno ai mezzi provoca un danno ossidativo diffuso che può essere un insulto troppo generale al tessuto per essere informativo per il processo cellulare di interesse, in particolare per esperimenti più lunghi che esaminano lo sviluppo. Anche se potrebbe non essere possibile eseguire esperimenti che richiedono la visualizzazione della cellula per lunghi periodi di tempo a causa di questo danno ossidativo rapido, esteso e probabilmente irreversibile, abbiamo visto che il trattamento acuto di perossido di idrogeno che abbiamo descritto è applicabile alla maggior parte degli stadi di oogenesi in quanto siamo in grado di vedere gli stessi effetti nella maggior parte delle fasi del periodo di imaging. Dato il basso costo e la facilità del protocollo, può essere un controllo utile per i danni e può essere utilizzato come trattamento prima della fissazione e dell'etichettatura degli anticorpi.

Nelle nostre mani, il trattamento H₂O₂ imita i cambiamenti nella delocalizzazione mitocondriale e nella dispersione delle particelle di beatitudine di Clu che vediamo in vari mutanti Drosophila. Imita anche i risultati che vediamo per i nuovi ricercatori nelle tecniche di dissezione dell'apprendimento in laboratorio. Pertanto, questo metodo ha rivelato chiaramente che la preparazione del campione e lo stress cellulare generale possono portare a cambiamenti imprevisti e precedentemente inspiegabili alla delocalizzazione mitocondriale e alla presenza di particelle di beatitudine. Spostando questa tecnica in avanti, le concentrazioni di perossido di idrogeno potrebbero essere modulate utilizzando una concentrazione più o meno elevata. Se si vede un effetto cellulare usando una concentrazione inferiore, è possibile che il fenotipo di stress possa essere reversibile sostituendo il supporto con quello di Complete Schneider. Diversi fattori di stress cellulare come carbonil cianuro m-clorofenil hydrazone (CCCP), arsenite o semplice shock termico potrebbero rivelarsi utili per lo stress cellulare generale per altre strutture subcellulari. Poiché l'imaging vivo di tessuti ex vivo richiede manipolazione manuale e incubazione in diversi mezzi, questo controllo dovrebbe essere un'aggiunta utile per garantire che eventuali osservazioni siano il più vicino possibile alla normale fisiologia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lievito secco attivo	Stella Rossa
CO2 gas			99,9% di purezza
CO2 pad
Microscopio da dissezione, modello Nikon SMZ645	Aghi
- Aghi PrecisionGlide	BD	305165	B-D 21G1
Aghi da dissezione - Siringhe PrecisionGlide	BD	309657	Punta Luer-Lok, 3 mL
Aghi da dissezione - filo di tungsteno	Microscopia elettronica Scienze	73800
Dumont #5 pinze (2 paia)	Fine Science Tools	11251-10
NI-150 Illuminatore ad alta intensità	Nikon Instruments Inc.
Gibco Siero fetale bovino, inattivato dal calore	Fisher Scientific	10082-147
Gibco Schneider's Drosophila Media	Sigma-Aldrich	21720-024
Soluzione di perossido di idrogeno, 30% (p/p) in H2O	Sigma-Aldrich	H1009
Insulina da pancreas bovino	Sigma-Aldrich	I6634
Disco rotante microscopio	Nikon		Possono essere utilizzati anche cannocchiali equivalenti
Lonza BioWhittaker Antibiotici: Miscele penicillina-streptomicina Fisher	Scientific	17-602E
MatTek Corporation Piatti con fondo in vetro, 35 mm	Fisher Scientific
Micropipette e puntali di dimensioni adeguate	Provette per
, 1,7 mL	VWR	87003-294
Tetrametilrodamina, estere etilico, perclorato (TMRE)	AnaSpec	AS-88061
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	5905	Mosche wild-type
y w; clu[CA06604]		Disponibile su richiesta.	Clu::GFP mosche trappola