Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.
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Articolo metodologico
Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole di segnalazione ben consolidate, che sono importanti nello sviluppo normale, nell'omeostasi e nella fisiologia. Tra i diversi ROS, il perossido di idrogeno (H2O2) è meglio caratterizzato rispetto ai ruoli nella segnalazione cellulare. H2O2 è stato implicato durante lo sviluppo in diverse specie. Ad esempio, un aumento transitorio di H2O2 è stato rilevato negli embrioni di zebrafish durante i primi giorni successivi alla fecondazione. Inoltre, l'esaurimento di un'importante sorgente cellulare H2O2, la NADPH ossidasi (NOX), compromette lo sviluppo del sistema nervoso come la differenziazione, la crescita assonale e la guida delle cellule gangliari retiniche (GRGC) sia in vivo che in vitro. Qui descriviamo un metodo per l'imaging dei livelli intracellulari H2O2 nei neuroni zebrafish coltivati e nelle larve intere durante lo sviluppo utilizzando il biosensore specifico di H2O2geneticamente codificato, roGFP2-Orp1. Questa sonda può essere espressa transitoriamente o stabilmente nelle larve di zebrafish. Inoltre, la lettura ratiometrica riduce la probabilità di rilevare artefatti dovuti all'espressione genica differenziale o agli effetti di volume. In primo luogo, dimostriamo come isolare e coltura le RGC derivate da embrioni di zebrafish che esprimono transitoriamente roGFP2-Orp1. Quindi, usiamo larve intere per monitorare i livelli di H2O2 a livello di tessuto. Il sensore è stato convalidato con l'aggiunta di H2O2. Inoltre, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per misurare i livelli di H2O2 in specifici tipi cellulari e tessuti generando animali transgenici con espressione biosensore specifica del tessuto. Poiché i pesci zebra facilitano le manipolazioni genetiche e dello sviluppo, l'approccio dimostrato qui potrebbe servire come pipeline per testare il ruolo di H2O2 durante lo sviluppo embrionale neuronale e generale nei vertebrati.
Introduzione
La segnalazione reattiva delle specie di ossigeno (ROS) regola lo sviluppo e il funzionamento del sistemanervoso 1. Un'importante fonte cellulare di ROS sono le ossidasi NADPH (NOX), che sono proteine transmembrana che generano superossido e perossido di idrogeno (H2O2)2. Gli enzimi NOX si trovano in tutto il sistema nervoso centrale (SNC) e il ROS derivato dal NOX contribuisce allo svilupponeuronale 3,4,5,6. Il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali ne....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati eticamente dal Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), seguendo le linee guida NIH con il protocollo 2006002050 approvato il 24/07/2020.
1. Preparazione di soluzioni
- Supporti E2 (1x)
- Preparare soluzioni E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando tutti i componenti mostrati nella tabella 1. Soluzioni Autoclave E2A, E2B ed E2C. Conservare a 4 °C.
- Per 1 supporto E2: combinare 5 mL di 100x E2A, 1 mL di 500x E2B e 1 mL di 500x E2C. Portare il volume a 500 mL con acqua sterile. Regolare il pH a 7,0-7,5. ....
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Risultati
Le RGC zebrafish coltivate estendono gli assoni entro 1 d. Un'immagine rappresentativa del rapporto 405/480 del biosensore H2O2è illustrata nella figura 4A. Il corpo cellulare, l'assone e i coni di crescita sono chiaramente visibili nei singoli neuroni. Questi neuroni possono essere sottoposti a diversi trattamenti nel tempo per monitorare i cambiamentiH 2O2. In precedenza abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 μM H2O 2 ai supportid.......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici che necessitano di attenzione in tutto questo protocollo. Riteniamo che considerare questi punti migliorerà il flusso sperimentale. Per la coltura RGC primaria, la sterilità dello ZFCM(-) è molto importante, poiché questo supporto di coltura non contiene antibiotici e la contaminazione può verificarsi prima o durante l'imaging. Per evitarlo, si consiglia di preparare e utilizzare ZFCM(-) solo all'interno di un armadio di biosicurezza e realizzare regolarmente nuovi supporti ZFCM(-) (Passa.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant R01NS117701), dalla National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), dall'Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), dalla Purdue Research Foundation (Grant 209911) e dall'Ufficio del Vice Presidente Esecutivo per la Ricerca e i Partenariati presso la Purdue University (Grant 210362). Ringraziamo il Dr. Cory J. Weaver e Haley Roeder per aver stabilito il protocollo culturale RGC zebrafish. Ringraziamo inoltre Haley Roeder per aver fornito i dati della Figura 4. Ringraziamo Leah Biasi e Kenny Nguyen per l'aiuto con la cultura RGC. Ringraziamo Gentry Lee per aver....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di coltura da 35 mm | Sarstedt | 83-3900 | |
| Piastra con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Agarosio | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Provette capillari in vetro borosilicato | Sutter/Fisher Scientific | NC9029378 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Vetro di copertura | Corning | 2850-22 | |
| Piastre di Petri monouso (100 x 15 mm) | VWR | 25384-094 | |
| Siero fetale bovino | ThermoFisher Scientific | 26140087 | |
| Glucosio | Sigma Aldich | G7528 | |
| HEPES | Sigma Aldich | H4034 | |
| Stampo ad iniezione | Strumenti di scienza adattiva | TU-1 | |
| Microscopio invertito | Nikon | TE2000 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | |
| Microscopia confocale a scansione laser | Zeiss | 710 | |
| Leibovitz's L-15 Medium con rosso fenolo | Gibco/Fisher Scientific | 11-415-064 | |
| Leibovitz's L-15 Medium senza rosso fenolo | Gibco/Fisher Scientific | 21-083-027 | |
| Agarosio a basso punto di fusione | Promega | V2111 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit di trascrizione | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| PBS | Hyclone/Fisher Scientific | SH3025601 | |
| Penicillina/streptomicina | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Fenolo Rosso | Sigma Aldich | P0290 | |
| Feniltiourea (PTU) | Sigma Aldich | P7629 | |
| Pneumatico PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Poli-D-Lisina (PDL) | Sigma Aldich | P7280 | |
| QiaQUICK PCR Kit di purificazione | QIAGEN | 28104 | |
| Topo ricombinante slit2 | R& D Systems | 5444-SL-050 | |
| Piruvato di sodio | Sigma Aldich | P5280 | |
| Steritop 0.22 µ m filtro | Millipore | S2GPT05RE | |
| TE Buffer | Ambion | AM9860 | |
| Tricaina Metansolfonato | Sigma Aldich | E10521 | |
| Estrattore verticale per pipette | David Kopf Instruments | 700C |
Riferimenti
- Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiolo....
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Ristampe e permessi
