Qui presentiamo un protocollo per adattare il metodo CLARITY dei tessuti cerebrali per retine a montaggio intero per migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retini e delle loro strutture subcellulari.
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Articolo metodologico
Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metodo di delipidazione dell'idrogel tissutale (CLARITY), originariamente sviluppato dal laboratorio Deisseroth, è stato modificato e ampiamente utilizzato per l'immunosociezione e l'imaging di campioni cerebrali spessi. Tuttavia, questa tecnologia avanzata non è ancora stata utilizzata per retine a montaggio intero. Sebbene la retina sia parzialmente trasparente, il suo spessore di circa 200 μm (nei topi) limita ancora la penetrazione di anticorpi nel tessuto profondo e riduce la penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione. Qui, abbiamo adattato il metodo CLARITY per le retine di topo a montaggio intero polimerizzandole con un monomero di acrilammide per formare un idrogel nanoporous e quindi cancellandole in solfato di dodecil di sodio per ridurre al minimo la perdita di proteine ed evitare danni ai tessuti. Le retine elaborate da CLARITY sono state immunosostenibili con anticorpi per neuroni retinali, cellule gliali e proteine sinaptiche, montate in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione e immagini. I nostri dati dimostrano che CLARITY può migliorare la qualità della colorazione immunoistochimica standard e dell'imaging per neuroni retinali e cellule gliali in preparazione a montaggio intero. Ad esempio, la risoluzione 3D delle strutture astronomie fini e dendritiche delle cellule di amacrina dopaminergica è stata molto migliorata da CLARITY. Rispetto alle retine integrali non lavorate, CLARITY può rivelare l'immunostaining per proteine sinaptiche come la proteina a densità postsinaptica 95. I nostri risultati mostrano che CLARITY rende la retina più otticamente trasparente dopo la rimozione dei lipidi e preserva le strutture fini dei neuroni retinali e delle loro proteine, che possono essere utilizzate regolarmente per ottenere l'imaging ad alta risoluzione dei neuroni retinali e delle loro strutture subcellulari in preparazione a montaggio intero.
Introduzione
La retina vertebrata è forse la parte più accessibile del sistema nervoso centrale (SNC), e serve come un modello eccellente per studiare lo sviluppo, la struttura e la funzione del cervello. Cinque classi di neuroni nella retina sono distribuite in tre strati nucleari separati da due strati plexiformi. Lo strato nucleare esterno (ONL) è costituito da fotorecettori classici (aste e coni) che convertono la luce in segnali elettrici. I segnali elettrici vengono elaborati dai neuroni nello strato nucleare interno (INL), comprese le cellule bipolari, orizzontali e amacrine, e quindi trasmessi alle cellule gangliari retiniche (RGC) nello strato cellulare ganglio (GCL). Le ....
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Protocollo
La cura del topo e tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo le linee guida del National Institutes of Health per gli animali da laboratorio e sono state approvate dagli Institutional Animal Care and Use Committees della Oakland University (protocollo n. 18071).
NOTA: I nomi delle soluzioni e le loro composizioni sono elencati nella tabella 1.
1. Preparazione dei tessuti
- Eutanasia del topo con un sovradosaggio di CO2, seguito da lussazione cervicale.
- Enucleare gli occhi con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS
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Risultati
Le retine modificate elaborate con CLARITY sono tessuti otticamente trasparenti.
Per formulare un metodo di compensazione dei tessuti compatibile con le applicazioni immunoistochimiche nella retina, fornendo al contempo un'adeguata delipidazione e mantenendo l'integrità strutturale delle proteine cellulari, abbiamo adattato il metodo di compensazione dei tessuti CLARITY alle retine di topo montate su intero. Siamo stati in grado di semplificare il protocollo e modificarlo per le retine a montaggio int.......
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Discussione
Modifica del protocollo CLARITY per retine a montaggio intero.
Abbiamo semplificato il protocollo CLARITY per ottenere un'adeguata polimerizzazione senza la necessità di una camera di evacuazione o essiccazione sottovuoto, come viene utilizzato nella maggior partedegli studi precedenti 7,9,11. Il processo di polimerizzazione è inibito dall'ossigeno, richiedendo che il campione sia isolato dall'aria durante la.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e dall'Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 16% Paraformaldeide | Microscopia Elettronica Scienze | 15710 | |
| Acrilammide | Fisher Biotech | BP170 | Monomero Idrogel |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Microscopio a fluorescenza | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Agente bloccante |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scansione confocale microscopio | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Componente tampone |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Componente tampone |
| Na2HPO4Sigma | Aldrich S9763 | Componente tampone | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Componente tampone |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Componente tampone |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Conservante batteriostatico |
| NDS | Aurion | 900.122 | Agente bloccante |
| Elementi NIS AR | Nikon | Software di analisi delle immagini | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Agente di delipidazione |
| Sorbitolo | Sigma Aldrich | 51876 | Componente tampone |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Tensioattivo |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Tensioattivo |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Iniziatore termico |
Riferimenti
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and ....
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Ristampe e permessi
