Creazione di chimere del proencefalo aviario per valutare lo sviluppo facciale

Sommario

Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stata progettata per testare le proprietà di segnalazione e pattern del proencefalo basale durante lo sviluppo craniofacciale.

Abstract

L'embrione aviario è stato utilizzato come sistema modello per più di un secolo e ha portato a una comprensione fondamentale dello sviluppo dei vertebrati. Uno dei punti di forza di questo sistema modello è che l'effetto e l'interazione tra i tessuti possono essere valutati direttamente negli embrioni chimerici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i segnali provenienti dal proencefalo contribuiscono alla morfogenesi facciale regolando la forma del dominio di espressione del riccio sonico (SHH) nella zona ectodermica frontonasale (FEZ). In questo articolo, viene descritto il metodo per generare le chimere del proencefalo e fornire illustrazioni dei risultati di questi esperimenti.

Introduzione

Gran parte della ricerca contemporanea in biologia dello sviluppo si concentra sul ruolo dei geni nella formazione degli embrioni. Ci sono buoni strumenti per esaminare i meccanismi di sviluppo da una prospettiva genetica. Tuttavia, gli embrioni vengono assemblati e subiscono morfogenesi in risposta alle interazioni tissutali. Il sistema aviario è uno strumento classico utilizzato per valutare la varietà di interazioni tissutali che regolano lo sviluppo per i seguenti motivi: l'embriologia è ben compresa, gli embrioni sono facilmente accessibili, gli strumenti per l'analisi dei sistemi aviari sono ben sviluppati e gli embrioni sono poco costosi.

Il sistema di trapianto aviario è stato ampiamente utilizzato per tracciare il lignaggio e per valutare le interazioni tissutali durante lo sviluppo per quasi un secolo 1,2,3,4. Questo sistema è stato utilizzato per studiare un centro di segnalazione, la zona ectodermica frontonasale (FEZ), che regola la morfogenesi della mascella superiore⁵, ed è stato pubblicato un video che descrive quella tecnica in precedenza⁶. Oltre al pulcino di quaglia, altre specie sono state utilizzate anche per produrre chimere per l'analisi delle interazioni tissutali. Ad esempio, il topo FEZ è stato trapiantato da topi selvatici di tipo⁷ e topi mutanti⁸, e altri hanno utilizzato un sistema di anatra, quaglia e pulcino per valutare il ruolo della cresta neurale nel modellare lo scheletro facciale 9,10,11,12.

In questo lavoro, è stato valutato il ruolo del proencefalo nella regolazione del modello di espressione genica nella zona FEZ trapiantando reciprocamente il proencefalo ventrale tra embrioni di quaglia, anatra e pulcino, perché è necessario un segnale dal proencefalo per indurre l'espressione del riccio sonico nella FEZ. I trapianti di proencefalo non sono unici nel campo. Questi trapianti sono stati utilizzati per valutare lo sviluppo della motilità negli embrioni di quaglia e anatra¹³, sebbene in questi esperimenti siano stati trapiantati anche tessuti che hanno contribuito a derivati non neurali. In altri lavori, i circuiti uditivi negli uccelli sono stati valutati mediante trapianto di proencefalo¹⁴, ma questi trapianti contenevano presunte cellule della cresta neurale, che contribuiscono alla forma del viso ^9,10 e partecipano alla regolazione dell'espressione di SHH nella FEZ ¹⁵. Quindi, è stato ideato un sistema per trapiantare solo il proencefalo ventrale da una specie di uccello a un'altra prima della chiusura del tubo neurale per valutare il ruolo del cervello nella forma facciale¹⁶ (Figura 1A, B). Questo metodo era privo di contaminazione della cresta neurale dell'innesto. In questo articolo, il metodo è illustrato e vengono descritti i risultati attesi e vengono discusse le sfide affrontate.

Protocollo

L'anatra pechinese bianca (Anas platyrhynchos), il pollo livornese bianco (Gallus gallus) e la quaglia giapponese (Cortunix coturnix japonica) vengono incubati a 37 °C in una camera umidificata fino allo stadio HH7/8¹⁷.

1. Preparazione del tessuto donatore

NOTA: È stata descritta la preparazione dei reagenti e degli strumenti e come aprire le uova per la manipolazione sperimentale⁶.

1. Preparare i supporti DMEM con rosso neutro, una pipetta di trasferimento di vetro e aghi di tungsteno affilati.
2. Esporre gli embrioni (come mostrato al^{punto 6}).
3. Innesti di tessuto prelevati dal lato sinistro del proencefalo basale degli embrioni allo stadio 7/8. Utilizzare aghi di tungsteno affilati curvi⁶ per incidere delicatamente un pezzo del proencefalo che misura ~ 0,3 mm di lunghezza per 0,2 mm di larghezza, assicurandosi di non includere l'endoderma sottostante facendo scorrere l'ago sotto il proencefalo in modo che l'ago sia parallelo all'asse del tubo neurale.
4. Utilizzando la pipetta di trasferimento di vetro, prelevare l'innesto dall'embrione donatore.
5. Trasferire l'innesto in DMEM contenente Neutral Red (0,01% in PBS, 23 °C) per 2 minuti per colorarlo, quindi posizionare l'innesto colorato in DMEM che non contiene Neutral Red fino al momento dell'attecchimento.

2. Preparazione dell'host

1. Incubare uova fecondate di pollo livornese bianco (Gallus gallus) a 37 °C in camera umidificata fino a HH7/8 ¹⁷.
2. Esporre gli embrioni (come mostrato al^{punto 6}).
3. Utilizzando aghi di tungsteno affilati, preparare il sito di innesto tagliando delicatamente, quindi rimuovendo un pezzo di proencefalo basale di 0,3 mm per 0,2 mm dal lato sinistro per ospitare l'innesto come è stato fatto per isolare il tessuto donatore.
4. Fare attenzione ad evitare un'eccessiva interruzione dell'endoderma sottostante, che sarà evidente poiché i granuli di tuorlo inizieranno a fuoriuscire attraverso qualsiasi lacrima che viene fatta. Questo richiede pratica e non tutti i tentativi avranno successo.
5. Dopo il trasferimento all'ospite⁶, posizionare l'innesto per sostituire il proencefalo basale estirpato dell'ospite.
6. Posizionare saldamente del nastro adesivo sul foro e riportare l'embrione nell'incubatore a 37 °C per il periodo di tempo appropriato per l'analisi.

Risultati

Valutazione del chimerismo e della contaminazione da trapianto
Al fine di valutare le chimere, deve essere affrontata l'entità del chimerismo e della contaminazione dell'innesto con altri tipi di cellule. La creazione di chimere trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino consente questo tipo di analisi. Utilizzando l'anticorpo QCPN le cellule di quaglia possono essere visualizzate e distinte dai tessuti ospiti (Figura 1 C,D). In questo caso, s...

Discussione

Il metodo descritto consente l'esame delle interazioni tissutali tra il proencefalo basale e l'ectoderma adiacente. Questo approccio differisce dai precedenti metodi di trapianto del proencefalo, perché il tessuto del donatore era limitato al proencefalo ventrale. Questo elimina il trapianto delle cellule della cresta neurale, che hanno dimostrato di partecipare al pattern della morfologia facciale ^9,10. Quindi, limitare l'innesto al proencefalo basale era essenz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1x PBS	TEK	TEKZR114
35x10 mm Piastra di Petri	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Porta aghi	Fine Science Tools	26016-12
Rosso neutro	Sigma	553-24-2
N. 5 Pinze Dumont	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN anticorpo	sullo sviluppo Banca di ibridomi, Iowa University, Iowa, USA
Forbici	Strumenti per le scienze fini	14058-11
Ago per tungsteno	Strumenti per le scienze fini	26000