Articolo metodologico

Utilizzo dell'embrione di pollo come potente strumento nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo

DOI:

10.3791/62189

⸱

21 marzo 2021

 ,  ,  , 
1School of Public Health, Qingdao University, 2Department of Pharmacology & Toxicology, Brody School of Medicine, East Carolina University

In questo articolo

Sommario

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Gli embrioni di pollo, come modello di sviluppo classico, vengono utilizzati nel nostro laboratorio per valutare le cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell'esposizione a vari contaminanti ambientali. I metodi di esposizione e i metodi di valutazione morfologica/funzionale stabiliti sono descritti in questo manoscritto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli embrioni di pollo sono un modello classico negli studi sullo sviluppo. Durante lo sviluppo degli embrioni di pollo, la finestra temporale dello sviluppo del cuore è ben definita ed è relativamente facile ottenere un'esposizione precisa e tempestiva attraverso più metodi. Inoltre, il processo di sviluppo cardiaco negli embrioni di pollo è simile ai mammiferi, risultando anche in un cuore a quattro camere, rendendolo un valido modello alternativo nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo. Nel nostro laboratorio, il modello dell'embrione di pollo viene utilizzato abitualmente nella valutazione delle cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell'esposizione a vari inquinanti ambientali, tra cui sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS), particolato (PM), gas di scarico diesel (DE) e nano materiali. Il tempo di esposizione può essere liberamente selezionato in base alle necessità, dall'inizio dello sviluppo (giorno embrionale 0, ED0) fino al giorno prima della schiusa. I principali metodi di esposizione includono l'iniezione di cellule aeree, la microiniezione diretta e l'inalazione di cellule aeree (originariamente sviluppate nel nostro laboratorio), e gli endpoint attualmente disponibili includono la funzione cardiaca (elettrocardiografia), la morfologia (valutazioni istologiche) e le valutazioni biologiche molecolari (immunoistochimica, qRT-PCR, western blotting, ecc.). Naturalmente, il modello di embrione di pollo ha i suoi limiti, come la limitata disponibilità di anticorpi. Tuttavia, con più laboratori che iniziano a utilizzare questo modello, può essere utilizzato per dare contributi significativi allo studio delle cardiotossicità dello sviluppo.

Introduzione

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L'embrione di pollo è un modello di sviluppo classico, che è stato utilizzato per oltre duecento anni1. Il modello di embrione di pollo ha vari vantaggi rispetto ai modelli tradizionali. Prima di tutto, già oltre 70 anni fa, il normale sviluppo dell'embrione di pollo era stato illustrato molto chiaramente nella guida alla stadiazione Hamburger-Hamilton2, in cui un totale di 46 fasi durante lo sviluppo dell'embrione di pollo sono state definite con precise caratteristiche temporali e morfologiche, facilitando il rilevamento di uno sviluppo anormale. Inoltre, il modello di embrione di pollo ha altre caratteristiche come l'essere relativamente a basso costo e ridondante in quantità, controlli relativamente accurati della dose di esposizione, un sistema indipendente e chiuso all'interno del guscio e una facile manipolazione dell'embrione in via di sviluppo, il che garantisce il suo potenziale per essere utilizzato come un potente modello di valutazione tossicologica.

In cardiotossicità, l'embrione di pollo presenta un cuore a quattro camere, simile ai cuori dei mammiferi ma con pareti più spesse, consentendo valutazioni morfologiche più facili. Inoltre, l'embrione di pollo consente l'esposizione per inalazione dello sviluppo, che non è possibile nei modelli di mammiferi: durante la fase successiva dello sviluppo, l'embrione di pollo passerà dalla respirazione interna alla respirazione esterna (ottenendo ossigeno attraverso il polmone); quest'ultimo richiede che l'embrione penetri nella membrana cellulare dell'aria con il becco e inizi a respirare aria3, rendendo la cellula aerea una mini-camera di inalazione. Utilizzando questo fenomeno, gli effetti tossicologici dei contaminanti gassosi sul cuore (e su altri organi) possono essere valutati senza la necessità di strumenti dedicati alla camera di inalazione.

In questo manoscritto sono descritti diversi metodi di valutazione dell'esposizione / endpoint, che servono a rendere l'embrione di pollo un potente strumento nella valutazione della cardiotossicità dello sviluppo a seguito dell'esposizione a contaminanti ambientali.

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Protocollo

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Tutte le procedure descritte sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Qingdao. Nel nostro laboratorio, le uova sono state incubate in due incubatrici. Le uova sono state tenute in posizione verticale nell'incubatrice e posizionate casualmente sugli scaffali. Le condizioni di incubazione per le uova erano le seguenti: la temperatura di incubazione è iniziata a 37,9 °C e gradualmente è diminuita a 37,1 °C man mano che procedeva l'incubazione; l'umidità è iniziata al 50% e gradualmente è aumentata fino al 70%.

1. Metodi di esposizione

NOTA: L'esposizione di contaminanti ambientali agli embrioni di pollo può essere ottenuta in diversi modi. In questa sezione vengono descritti in dettaglio tre metodi utilizzati di routine.

  1. Iniezione di cellule d'aria (Figura 1)
    NOTA: Questo è il metodo classico di esposizione agli embrioni di pollo4,5,6,adatto a una vasta gamma di materiali, e può essere eseguito in una finestra temporale molto ampia, dall'inizio dello sviluppo (giorno embrionale zero, ED0) fino al giorno prima della schiusa (ED20). L'olio di girasole viene utilizzato come veicolo. Studi precedenti hanno dimostrato che non sono stati osservati cambiamenti significativi nella mortalità, nella schiudibilità o nel peso corporeo tra embrioni non trattati ed embrioni iniettati con olio di girasole7.
    1. Preparare i seguenti reagenti / strumenti necessari: etanolo al 75%, carta velina, sonda metallica (può sostituire con qualsiasi ago / bastone / punteruolo in metallo affilato), paraffina fusa, pennello, soluzione di ioduro di povidone, pipetta, punte per pipette, lampada di candling, miscela dosante. Preparare la miscela dosante con olio di semi di girasole (consigliato)4. Per utilizzare altri diluenti, eseguire il controllo del veicolo (rispetto agli embrioni non trattati).
    2. Pulire la superficie delle uova con la soluzione di ioduro di povidone (soluzione di ioduro di povidone disponibile in commercio 1:5 diluita con acqua deionizzata) e asciugare il guscio d'uovo con carta velina senza strofinare. Lo scrubbing romperà lo strato protettivo che ricopre l'esterno del guscio.
    3. Candela le uova in una stanza buia e segna la cella d'aria con la matita. Escludere le uova con crepe sul guscio. Escludere le uova con celle d'aria sul lato invece della punta smussata, poiché è altamente improbabile che si schiudano normalmente.
    4. Disinfettare l'area della cella d'aria con etanolo al 75% e quindi praticare un piccolo foro al centro dell'area della cella d'aria con la sonda metallica. Non infilare la sonda in profondità nella cella d'aria o la membrana interna potrebbe essere danneggiata, invece, rompere solo il guscio con la punta della sonda. Se il foro non è abbastanza grande da adattarsi a una punta di pipetta fine, rompere nuovamente il guscio in prossimità del foro esistente, fino a quando il foro non è abbastanza grande da consentire l'inserimento della punta della pipetta da 10 μL.
    5. Vorticosamente la miscela dosante vigorosamente e aspira immediatamente la soluzione sulla punta della pipetta. Il volume di iniezione raccomandato è di 1 μL per 10 grammi di uovo (ad esempio, 5 μL di volume di iniezione per un uovo da 50 grammi) poiché volumi di iniezione maggiori possono creare condizioni ipossiche o anosseche per l'embrione in via di sviluppo. Calcolare la concentrazione della soluzione dosatrice per la dose desiderata di mg/kg di uovo.
    6. Inserire la punta della pipetta nel foro, con la punta che tocca la membrana interna. Espellere lentamente la miscela dosatrice, tenere premuto per almeno dieci secondi (lasciare che l'olio viscoso sia completamente erogato), quindi rimuovere la punta.
    7. Sigillare il foro con un pennello e una goccia di paraffina fusa. Fare attenzione a non gocciolare paraffina fusa sulla membrana interna.
    8. Una volta sigillate, mettere le uova nell'incubatrice fino a raggiungere lo stadio embrionale desiderato. Sugli embrioni già in via di sviluppo, eseguire l'intero processo il prima possibile per prevenire la potenziale perdita di embrioni a causa delle basse temperature ambientali.
  2. Microiniezione (Figura 2)
    NOTA: Questo è un metodo di esposizione più diretto, con conseguente esposizione definitiva alla sostanza di interesse, e particolarmente adatto per composti con una breve durata d'azione (ad esempio, lentivirus), poiché l'iniezione classica di cellule aeree richiede tempo affinché i composti penetrino nella membrana interna. Questo metodo può anche essere provato se non è possibile ottenere risultati soddisfacenti con l'iniezione di cellule aeree. Questo metodo è più adatto per gli embrioni precoci (fino a ED2), ma può anche essere eseguito su embrioni più anziani (con maggiore rischio di perdita di embrioni).
    1. Preparare i seguenti reagenti / strumenti necessari: etanolo al 75%, soluzione di ioduro di povidone, microiniettore (5 μL), sonda metallica (può sostituire con qualsiasi ago / bastone / punteruolo metallico affilato dovrebbe funzionare), pinna fine, nastro. Preparare la miscela dosante con soluzione salina sterile, che funge anche da controllo dell'iniezione senza influire in modo significativo sulla schiudibilità. Garantire la sterilità della soluzione salina, poiché un'iniezione contaminata aumenterà drasticamente la mortalità.
    2. Pulire le uova come descritto al 1.1.2.
    3. Candele le uova come descritto al 1.1.3.
    4. Disinfettare l'area della cella d'aria con etanolo al 75% e quindi praticare un piccolo foro al centro dell'area della cella d'aria con la sonda metallica. Non infilare la sonda in profondità nella cella d'aria o la membrana interna potrebbe essere danneggiata, invece, rompere solo il guscio con la punta della sonda. Quindi utilizzare la pinica fine per allargare con cura il foro fino a quando il diametro è di circa 2 mm, consentendo la conferma visiva della membrana interna.
    5. Caricare la soluzione nel microiniettore (volume massimo di iniezione: 0,5 μL/10 g di uovo. (ad esempio, 2,5 μL per un uovo da 50 g) e inserire con attenzione l'ago attraverso il foro nella membrana interna per circa 2-3 mm. Erogare delicatamente la soluzione e rimuovere l'ago. Tenere l'ago il più perpendicolare possibile alla membrana.
    6. Sigillare il foro con un piccolo pezzo di nastro. Coprire completamente il foro per prevenire la disidratazione e la morte dell'embrione durante la successiva incubazione. Tuttavia, evitare pezzi di nastro troppo grandi per prevenire l'ipossia.
    7. Una volta sigillate, mettere le uova nell'incubatrice fino a raggiungere lo stadio embrionale desiderato. Sugli embrioni già in via di sviluppo, eseguire l'intero processo il prima possibile per prevenire la potenziale perdita di embrioni a causa della bassa temperatura ambientale.
  3. Inalazione di cellule d'aria (Figura 3)
    NOTA: Questo è un nuovo metodo di inalazione che sfrutta la cellula aerea, da cui l'embrione di pollo in fase avanzata inizierà a respirare aria. È adatto per esposizioni a gas o aerosol e può ottenere esposizioni per inalazione molto precoci nella vita e riempire i polmoni con il gas / aerosol target quando si aprono per la prima volta nella vita.
    1. Preparare i seguenti reagenti / strumenti necessari: sacchetto di campionamento (sacchetto PVF, per la conservazione del campione di gas / aerosol prima dell'esposizione), ago del catetere, siringa, sonda metallica (può sostituire con qualsiasi ago / bastone / punteruolo metallico affilato dovrebbe funzionare), nastro, cappa aspirante.
    2. Pulire le uova come descritto al punto 1.1.2 e candele come descritto al punto 1.1.3 (non è necessario contrassegnare le cellule d'aria prima dell'incubazione), quindi incubare le uova senza trattamento fino a ED17.
    3. Candela le uova a ED17 per contrassegnare l'area della cella d'aria.
    4. A ED18, eseggia un uovo dall'incubatrice, disinfetta l'area della cella d'aria con il 75% di etanolo e quindi pratica con attenzione due piccoli fori su due lati della cella d'aria. Uno è per l'iniezione di gas / aerosol, l'altro è per l'espulsione di aria. Controllare attentamente la dimensione dei fori in modo che la dimensione del foro di iniezione sia appena sufficiente per l'inserimento dell'ago del catetere, mentre il diametro del foro di espulsione è un po 'più grande (circa 1 mm).
    5. Iniettare delicatamente 10 mL di gas/aerosol bersaglio dal foro di iniezione con una siringa attaccata all'ago del catetere. Iniettare aria per un gruppo di controllo per inalazione, che non dovrebbe avere differenze significative rispetto a un gruppo di controllo negativo8. Applicare una pressione contro l'ago del catetere (con una quantità appropriata di pressione l'ago elastico può essere spinto contro il guscio) per ridurre al minimo la perdita dal foro di iniezione. Sigillare entrambi i fori immediatamente con del nastro adesivo e riportare l'uovo all'incubatrice.
      NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in una cappa aspirante per impedire l'inalazione di gas/aerosol da parte dell'operatore.
    6. Ripetere la procedura descritta dopo un'ora per assicurarsi ulteriormente che l'intera cella d'aria sia riempita con gas/aerosol target (opzionale).
    7. Ripetere nuovamente la procedura descritta in ED19 (facoltativo). Ripetere l'esposizione aiuta a garantire un'esposizione costante fino alla schiusa. Registrare il tempo di schiusa per una stima approssimativa della durata dell'esposizione.
    8. Una volta che le esposizioni desiderate sono state eseguite e sigillate, posizionare le uova nell'incubatrice per la schiusa. Ridurre al minimo il tempo che l'uovo trascorre al di fuori dell'incubatrice per evitare la morte a causa della bassa temperatura ambientale.

2. Metodi di valutazione degli endpoint

NOTA: A seguito dell'esposizione di contaminanti di interesse all'embrione in via di sviluppo, possono essere valutati diversi parametri di tossicità, tra cui la cardiotossicità. In questa sezione vengono descritti in dettaglio due metodi specifici utilizzati di frequente.

  1. Elettrocardiografia (Figura 4)
    NOTA: È impossibile eseguire l'elettrocardiografia non invasiva nei polli da cova a causa della presenza di piume. Pertanto, l'impianto sottocutaneo di elettrodi è essenziale, richiedendo anestesia. La dose utilizzata in laboratorio è di 33 mg/kg di pentobarbital tramite iniezione intraperitoneale (alcuni polli possono richiedere un aumento della dose fino al 50%). Questo metodo si tradurrà in un'elettrocardiografia stabile in oltre il 90% degli animali, consentendo l'analisi della frequenza cardiaca.
    1. Preparare i seguenti reagenti/strumenti necessari: soluzione di pentobarbital all'1% (10 mg/ml) in soluzione salina, siringa, bilancio elettrico, riscaldatore (se necessario), uno strumento di elettrocardiografia collegato (ad esempio, BL-420E+) con elettrodi metallici ad ago a due canali.
    2. Pesare i polli con una bilancia e calcolare il volume necessario di soluzione di pentobarbital e iniettare i polli. Per un pollo che pesa 30 g, sono necessari 0,1 ml di soluzione di pentobarbital. Assicurarsi che l'iniezione venga eseguita sul lato laterale dell'addome, poiché il tuorlo si trova al centro e l'iniezione potrebbe non essere efficace.
    3. Attendere che i polli iniettati siano anestetizzati (tenere il pollo in mano, se il collo non ha tensione e la testa può essere ruotata liberamente, l'anestesia è sufficiente). Posizionare i polli sul tavolo operatorio (i riscaldatori sono necessari se la temperatura ambiente è inferiore a 20 °C).
    4. Inserire due elettrodi ad ago da due lati dell'addome, per via sottocutanea. Assicurarsi che gli aghi non entrino nella cavità addominale sollevando un po 'la pelle e inserendo l'ago da lì. Una volta inserito, spingere con attenzione l'ago in avanti fino a raggiungere il lato della cavità toracica. Assicurarsi che l'ago non vada in profondità nel corpo o scuota dalla pelle.
    5. Effettuare le misurazioni con lo strumento di elettrocardiografia. Possono essere utilizzati altri strumenti simili in grado di elettrocardiografia.
    6. Se i polli devono essere sacrificati, eseguire l'eutanasia dopo l'elettrocardiografia poiché sono già in anestesia. Se i polli devono sopravvivere, rimetterli nelle loro gabbie e riscaldarli fino al risveglio. Restituirli all'incubatore è un'altra opzione.
  2. Istomorfometria (Figura 5)
    NOTA: Viene sviluppato un metodo specifico per valutare lo spessore della parete ventricolare destra nelle sezioni trasversali del cuore. La valutazione morfologica della dimensione del ventricolo destro tramite ecocardiografia non è accurata al 100% a causa della forma irregolare del ventricolo destro e questo metodo può servire come un buon supplemento nelle valutazioni morfologiche per il ventricolo destro.
    1. Preparare i seguenti reagenti/strumenti necessari: formaldeide tamponata con fosfato al 4%, lama affilata, soluzione salina tamponata con fosfato, carta assorbente, bilancio elettrico, piccole forbici, agenti di lavorazione istologica generale (etanolo graduato, xilene, paraffina).
    2. Una volta che gli animali vengono sacrificati, usa l'acqua per bagnare le piume. Questo per ridurre al minimo la potenziale contaminazione dovuta alle piume volanti durante l'apertura del torace.
    3. Aprire la cavità toracica con attenzione senza danneggiare il cuore. Utilizzare piccole forbici per tagliare la vascolarizzazione e rimuovere delicatamente il cuore dalla cavità toracica. Lasciare un piccolo pezzo (circa 1-2 mm) di vascolarizzazione attaccato al cuore in quanto ciò può essere conveniente per la successiva manipolazione del cuore senza danneggiare il cuore.
    4. Una volta rimosso, sciacquare il cuore in soluzione salina tamponata con fosfato freddo per rimuovere il sangue e rilassare il muscolo. Quindi immergere il cuore su carta assorbente prima di pesare per una lettura accurata del peso. Mettere il cuore in un fissativo di volume 10x (formaldeide tamponata con fosfato al 4%) per 24 ore a temperatura ambiente. I tessuti fissi possono essere successivamente trasformati in blocchi di paraffina o conservati a 4 °C per anni (non raccomandato se è prevista l'immunoistochimica).
    5. Prima di incorporare, tagliare i tessuti a circa il 60% di lunghezza del conteggio del cuore dall'apice (Figura 5A), per facilitare la successiva elaborazione. Una lama microtomatica è consigliata per un taglio pulito rapido e verticale. Per i polli di età superiore a un giorno, effettuare un altro taglio a circa il 25-30% di lunghezza dall'apice per facilitare la penetrazione della paraffina e per consentire al tessuto di adattarsi alle cassette di tessuto.
    6. Elaborare i tessuti con le seguenti condizioni (regolare secondo necessità): 70% di etanolo per 1 ora, 80% di etanolo per 1 ora, 95% di etanolo per 1 ora x2, 100% di etanolo per 30 min x2, xilene per 5 min x2, paraffina (punto di fusione 52-54 °C) per 1,5 h, paraffina (punto di fusione 62-64 °C) per 1 ora, quindi incorporare i tessuti in una miscela 3:1 di paraffina (punto di fusione 62-64 °C) e paraffina (punto di fusione 52-54 °C).
    7. Seziona il tessuto a 6 μm di spessore. Mantenere con attenzione posizioni relative identiche delle sezioni trasversali confermando la presenza e le dimensioni di un punto di riferimento anatomico (trabecola settomarginale) nel ventricolo destro. Confermare un punto di riferimento con lunghezza moderata su ogni sezione (Figura 5B, freccia).
    8. Crea due righelli elettronici con programmatore Logo: il righello 1 è una linea retta con 7 linee di misura del raggio attaccate al punto centrale, con 22,5 ° tra due linee di misura adiacenti. Il righello 2 è solo due linee perpendicolari a forma di T (Figura 5B).
    9. Misura con due programmi software: Adobe Photoshop e ImageJ.
      1. In Photoshop, ridimensionate il righello 1 (NO rimodellamento) per posizionare le due estremità del righello sulle due estremità della parete ventricolare destra libera, in modo che le sette linee di misura sul righello 1 incontrino ciascuna la parete ventricolare destra interna. Quindi utilizzare il righello 2 per effettuare misurazioni perpendicolari dalla parete ventricolare interna a quella esterna (Figura 5B).
      2. Usa ImageJ per effettuare le sette misurazioni per ogni cuore.
    10. A seconda delle esigenze specifiche, analizzare le sette misurazioni o la media per uno spessore rappresentativo della parete ventricolare destra. Normalizzarsi a peso cardiaco intero per specifici cambiamenti di spessore della parete ventricolare.

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Risultati

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Risultati dell'esposizione
Iniezione di celle d'aria
L'iniezione di cellule aeree può esporre efficacemente lo sviluppo di embrioni di pollo a vari agenti, che possono essere successivamente rilevati nei campioni raccolti (siero, tessuto, ecc.) di embrioni / polli da cova. Ecco un esempio, in cui l'acido perfluoroottonico (PFOA) è stato iniettato da cellule d'aria e le concentrazioni sieriche di PFOA sono state quindi determinate con cromatografia liquida ad alte prestazioni-spettrometria di massa. Le concentrazion...

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Discussione

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L'embrione di pollo è stato un modello classico negli studi sullo sviluppo per 200 anni1. I nostri metodi presentati in questo manoscritto sono stati utilizzati nella valutazione di diversi contaminanti ambientali, tra cui acido perfluoroottanoico, particolato e gas di scarico diesel con successo5,7,8,9,10,1...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Formaldeide tamponata con fosfato al 4%Biosharp, Hefei, CinaREF: BL539A
75% etanoloGuoyao, Shanghai, CinaCAS:64-17-5
Monitor di biosegnalazione BL-420E+Taimeng, Chengdu, CinaBL-420E+
Lampada sperataZhenwei, Dezhou, CinaWZ-001
Siringa monousoZhiyu, Jiangsu, Cina
Incubatrice per uovaKeyu, Dezhou, CinaKFX
Bilancia elettricaOHAUS, Shanghai, CinaAR 224CN
Incubatrice elettrotermicaShenxian, Shanghai, CinaDHP-9022
Etanolo assolutoGuoyao, Shanghai, CinaCAS: 64-17-5
Uovodi gallina fertileJianuo, Jining, Cina
Kit di colorazione ematossilina ed eosinaBeyotime, Pechino, CinaC0105
Istologia paraffinaAladino, Shanghai, CinaP100928-500gPunto di fusione 52 ~ 54 ... C
Istologia paraffinaAladino, Shanghai, CinaP100936-500gPunto di fusione 62 ~ 64 °
C Catetere IVKDL, Zhejiang, CinaI cateteri devono essere morbidi e in plastica.
LentivirusGenechem, Shanghai, CinaI lentivirus sono stati progettati/sintetizzati individualmente da Genechem.
Kit di colorazione tricromica di MassonSolarbio, Pechino, CinaG1340
Sonda metallicaJinuotai, Pechino, Cina
Microiniettore (5 uL)Anting, Shanghai, Cina
MicroscopioCAIKON, Shanghai, CinaMicrotomo XSP-500
Leica, GermaniaMicrotomo HistoCore BIOCUT
lamaLeica, GermaniaLeica 819
Pentobarbitual sodioYitai Technology Co., Ltd., Wuhan, CinaCAS: 57-33-0
Pipetter (10ul)Sartorius, Germania
Povidone ioduroLongyuquan, Taian, Cina
ForbiceAnqisheng, Suzhou, Cina
Soluzione salina sterileKelun, Chengdu, Cina
Olio di girasoleMighty Jiage, Jiangsu, CinaQualsiasi olio di girasole commerciale per il consumo umano dovrebbe funzionare
NastroM & G, Shanghai, Cina
Tedlar PVF Bag (5L)Delin, Dalian, Cina
Vortex mixerSCILOGEX, Rocky Hill, CT, USMX-F
XyleneGuoyao, Shanghai, CinaCAS: 1330-20-7

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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