Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente

Summary

Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.

Abstract

Più di 700 varianti del gene RYR1 sono state identificate in pazienti con diversi disturbi neuromuscolari tra cui suscettibilità all'ipertermia maligna, miopatie core e miopatia centronucleare. A causa dei diversi fenotipi legati alle mutazioni RYR1 è fondamentale caratterizzare i loro effetti funzionali per classificare le varianti trasportate dai pazienti per futuri interventi terapeutici e identificare le varianti non patogene. Molti laboratori sono stati interessati a sviluppare metodi per caratterizzare funzionalmente le mutazioni RYR1 espresse nelle cellule dei pazienti. Questo approccio presenta numerosi vantaggi, tra cui: le mutazioni sono espresse endogenamente, RyR1 non è sovraespresso, l'uso di cellule eterologhe che esprimono RyR1 è evitato. Tuttavia, poiché i pazienti possono presentare mutazioni in geni diversi oltre a RYR1, è importante confrontare i risultati di materiale biologico di individui che ospitano la stessa mutazione, con background genetici diversi. Il presente manoscritto descrive i metodi sviluppati per studiare gli effetti funzionali delle varianti RYR1 espresse endogenamente in: (a) il virus di Epstein Barr ha immortalato i linfociti B umani e (b) le cellule satelliti derivate da biopsie muscolari e differenziate in miotubi. Vengono quindi monitorate le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio innescate dall'aggiunta di un attivatore RyR1 farmacologico. Il tipo di cellula selezionato viene caricato con un indicatore di calcio fluorescente raziometrico e le variazioni intracellulari [Ca²⁺] vengono monitorate a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza o in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro. Le curve di risposta alla dose agonista [Ca²⁺], a riposo vengono quindi confrontate tra cellule provenienti da controlli sani e pazienti che ospitano varianti RYR1 portando a comprendere l'effetto funzionale di una determinata variante.

Introduction

Ad oggi sono state identificate più di 700 varianti di RYR1 nella popolazione umana e legate a vari disturbi neuromuscolari tra cui la suscettibilità all'ipertermia maligna (MHS), la rabdomiolisi indotta dall'esercizio, la malattia del nucleo centrale (CCD), la malattia multi-minicore (MmD), la miopatia centronucleare (CNM)^1,2,3 ; tuttavia, gli studi per caratterizzare i loro effetti funzionali sono in ritardo e solo circa il 10% delle mutazioni sono state testate funzionalmente. Diversi approcci sperimentali possono essere utilizzati per valutare l'impatto di una data varian....

Protocol

I protocolli descritti di seguito sono conformi alle linee guida etiche dell'Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Preparazione delle linee cellulari dei linfociti B immortalati di Epstein Barr¹¹

1. Dopo il consenso informato, raccogliere 30 ml di sangue intero in tubi sterili trattati con EDTA dal proband portatore di una mutazione RYR1 e da membri sani della famiglia senza mutazione.
   NOTA: Mantenere tutte le soluzioni sterili e lavorare in una cappa di coltura di tessuto.
2. Isolare le cellule mononucleate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità (ad esempio....

Results

[Ca²⁺]_i misurazioni in popolazioni di linfociti B immortalizzati EBV
I linfociti B primari esprimono l'isoforma RyR1 che funziona come canale di rilascio di Ca²⁺ durante i processi di segnalazione stimolati dal recettore dell'antigene delle cellule B¹⁷. L'immortalizzazione delle cellule B con EBV, una procedura abitualmente utilizzata dai genetisti per ottenere linee cellulari .......

Discussion

I protocolli descritti in questo articolo sono stati utilizzati con successo da diversi laboratori per studiare l'impatto delle mutazioni RYR1 sull'omeostasi del calcio. I passaggi critici degli approcci delineati in questo documento riguardano la sterilità, le capacità e le tecniche di coltivazione cellulare e la disponibilità di materiale biologico. In linea di principio, l'uso di linfociti B immortalizzati EBV è più semplice e consente di generare linee cellulari contenenti canali RyR1 mutanti. Le cellule possono esse.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-cloro-m-cresolo	Fluka	24940
Provette per la raccolta del sangue	Sarstedt	172202
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
caffeina	Merk	102584
Cascade 125+ CCD camera	Fotometria
Cascade 128+ CCD	Fotometria
Creatina	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific 11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Siero fetale per vitelli	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Siero per cavalli	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher	Scientific A11382II
Ionomicina	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lantanio	Fluka	61490
Sistema di microperfusione	ALA-Scientific	DAD VM 12 collettore
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillina/Streptomicina	Gibco Life Sciences	15140-122
Camera di perfusione POC-R	Pecon	000000-1116-079
poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
spettrofluorimetro	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Piastre per coltura tissutale	Falcon	353046
Fiaschetta per coltura tissutale	Falcon	353107
Inserti per coltura tissutale	Falcon	353090
Soluzione di tripsina/EDTA	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 Microscopio TV	Carl Zeiss AG
Vetrini in vetro Zeiss	Carl Zeiss AG	0727-016