Questo lavoro descrive in dettaglio solide routine di base su come preparare campioni di proteine di membrana marcati con isotopi e analizzarli ad alta risoluzione con i moderni metodi di spettroscopia NMR allo stato solido.
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Articolo metodologico
Studi ad alta risoluzione di proteine in membrane naturali mediante NMR allo stato solido
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine di membrana sono vitali per la funzione cellulare e quindi rappresentano importanti bersagli farmacologici. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (ssNMR) offre un accesso unico per sondare la struttura e la dinamica di tali proteine in membrane biologiche di complessità crescente. Qui, presentiamo la moderna spettroscopia NMR allo stato solido come strumento per studiare la struttura e la dinamica delle proteine nelle membrane lipidiche naturali e su scala atomica. Tali studi spettroscopici traggono vantaggio dall'uso di metodi ssNMR ad alta sensibilità, ovvero ssNMR rilevata da protoni (1H) e ssNMR supportata da DNP (Dynamic Nuclear Polarization). Utilizzando la proteina batterica BamA della membrana esterna e il canale ionico KcsA, presentiamo metodi per preparare proteine di membrana marcate con isotopi e per derivare informazioni strutturali e motorie mediante ssNMR.
Introduzione
Gli studi strutturali e motori delle proteine di membrana in ambienti fisiologicamente rilevanti rappresentano una sfida per le tradizionali tecniche di biologia strutturale1. I moderni metodi di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (ssNMR) offrono un approccio unico per la caratterizzazione delle proteine di membrana 2,3,4,5,6,7 e sono stati a lungo utilizzati per studiare le proteine di membrana, comprese le pompe proteiche incluse nella membrana 8,
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Protocollo
1. Produzione di BamA-P4P5 etichettati in modo uniforme 2H, 13C, 15N
NOTA: Sebbene questo protocollo richieda di lavorare con batteri Gram-negativi non patogeni, l'aderenza alle procedure di sicurezza biologica di base è un must, vale a dire indossare occhiali di sicurezza, camici da laboratorio, guanti e seguire le procedure operative standard istituzionali per il lavoro con i microrganismi.
- Utilizzare una singola colonia di E. coli BL 21 Star (DE3) contenente il plasmide pET11aΔssYaeT che codifica per E. coli BamA-P4P5 per inoculare 50 ml di b....
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Risultati
La Figura 2 mostra i gel rappresentativi per la purezza dei corpi di inclusione (Pannello A) e il ripiegamento dei corpi di inclusione (Pannello B3). La Figura 2 conferma il successo della purificazione di 13 C,15N-marcato BamA-P4P5.
La Figura 3A mostra un tipico spettro 2D 13 C-13C di una proteina di membrana ben ordinata, mentre la Figura .......
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Discussione
Le proteine di membrana sono attori chiave nella regolazione delle funzioni cellulari vitali sia negli organismi procarioti che eucarioti; Pertanto, comprendere i loro meccanismi d'azione a livelli atomici di risoluzione è di vitale importanza. Le attuali tecniche di biologia strutturale hanno spinto la comprensione scientifica delle proteine di membrana molto lontano, ma si sono basate su dati sperimentali raccolti da sistemi in vitro privi di membrane. In questo articolo, viene present.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro fa parte dei programmi di ricerca ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI e VIDI con i numeri di progetto 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 e 718.015.00, finanziati dal Consiglio olandese delle ricerche (NWO). Questo articolo è stato supportato da iNEXT-Discovery (numero di progetto 871037).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Molibdato di ammonio | Merck | 277908 | |
| Cloruro di ammonio-15N | Cortecnet | CN80P50 | |
| Ampicillina | Sigma Aldrich | A9518 | |
| AMUpol | Cortecnet | C010P005 | |
| Benzonasi | EMD Millipore Corp | 70746-3 | |
| Acido borico | Merck | B6768 | |
| blu di bromofenolo | Sigma | B0126 | |
| dicloruro di calcio | Merck | 499609 | |
| Cloruro di colina | Sigma | C-1879 | |
| Cloruro di cobalto | Merck | 449776 | |
| Solfato di rame | Merck | C1297 | |
| D-Biotina | Merck | 8512090025 | |
| Ossido di deuterio | Cortecnet | CD5251P1000 | |
| Dimetil solfossido Merck | D9170 | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma Aldrich | L6876 | |
| Acido folico | Sigma | F-7876 | |
| Glucosio 13C + 2H | Cortecnet | CCD860P50 | |
| Glicerolo | Honeywell | G7757 | |
| Glicerolo (12C3, 99,95% D8, 98%) | Eurisotopo | CDLM-8660-PK | |
| glicerolo (non arricchito) | Honeywell | G7757-1L | |
| Glicina | Sigma Aldrich | 50046 | |
| Guanidina cloridrato | Roth Carl | NR.0037.1 | |
| Solfato di ferro | Merck | 307718 | |
| isopropilico β-D-1-tiogalattopiranoside | Thermofisher | R0392 | |
| Brodo di lisogenesi | Merck | L3022 | |
| Lisozima | Sigma Aldrich | L6876 | |
| Cloruro di magnesio - esaidrato | Fluka | 63064 | |
| solfato di magnesio | Merck | M5921 | |
| fosfato monopotassico | Merck | 1051080050 | |
| mioinositolo | Sigma | I-5125 | |
| n-dodecil-B-D-maltoside | Acros Organics | 3293702509 | |
| N,N-dimetildodecilammina N-ossido | Merck | 40236 | |
| Nicatinamide | Sigma | N-3376 | |
| Acido pantotenico | Sigma | 21210-25G-F | |
| inibitore della proteasi | Sigma | P8849 | |
| Piridossal-HCl | Sigma Aldrich | P9130 | |
| Riboflavina | Aldrich | R170-6 | |
| Cloruro di sodio | Merck | K51107104914 | |
| Sodio diidrogeno fosfato - monoidrato | Sigma Aldrich | 1,06,34,61,000 | |
| Sodio dodecil solfato | Termoscientifico | 28365 | |
| Idrossido di sodio | Merck | 1,06,49,81,000 | |
| Saccarosio | Sigma Life Science | S9378 | |
| Tiamina-HCl | Merck | 5871 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 10,70,89,76,001 | |
| Cloruro di zinco | Merck | 208086 | |
| E.coli BL21 DE3* | New England Biolabs | C2527 | |
| 1,5 mL Ultra-provette | Beckman Coltro | 357448 | |
| filtro centrifugo da 30 kDa | Amicon UFC903024 | ||
| rotore DNP in zaffiro da 3,2 mm con tappi | Cortecnet | H13861 | |
| inserto in teflon da 3,2 mm | Cortecnet | B6628 | |
| packer/disimballatore di campioni da 3,2 mm | Cortecnet | B6988 | |
| Rotore MAS a parete regolare da 3,2 mm | Cortecnet | HZ16913 | |
| Rotore MAS a parete normale da 3,2 mm | Cortecnet | HZ09244 | |
| per rotore a parete sottile da 3,2 mm Rotore | MAS Cortecnet | B136904 | |
| 1,3 mm + tappi Cortecnet | HZ14752 | ||
| Strumento di riempimento da 1,3 mm | Cortecnet | HZ14714 | |
| 1,3 | |||
| mm | Cortecnet | HZ14706 | |
| 1,3 mm set di tappi | Cortecnet | HZ14744 | |
| Tubo per dialisi 12-14 kDa | Spectra/Por | 132703 | |
| Sharpie - Nero | Merck HS15094 |
Riferimenti
- Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 2037-2046 (2013).
- Kaplan, M., Pinto, C., Houben, K., Baldus, M. Nuclear magnetic resonance (NM....
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Ristampe e permessi
