Qui, presentiamo un protocollo per generare ed espandere in modo robusto i cardiomiociti umani dalle cellule mononucleate del sangue periferico del paziente.
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Articolo metodologico
Generazione ed espansione di cardiomiociti umani da cellule mononucleate del sangue periferico del paziente
In questo articolo
Sommario
Abstract
La generazione di cardiomiociti specifici del paziente da un singolo prelievo di sangue ha attirato un enorme interesse per la medicina di precisione sulle malattie cardiovascolari. La differenziazione cardiaca dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) è modulata da percorsi di segnalazione definiti che sono essenziali per lo sviluppo del cuore embrionale. Numerosi metodi di differenziazione cardiaca su piattaforme 2D e 3D sono stati sviluppati con varie efficienze e resa cardiomiocitaria. Ciò ha sconcertato gli investigatori al di fuori del campo in quanto la varietà di questi metodi può essere difficile da seguire. Qui presentiamo un protocollo completo che elabora una robusta generazione ed espansione di cardiomiociti specifici del paziente da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Per prima cosa descriviamo un protocollo di riprogrammazione iPSC ad alta efficienza dal campione di sangue di un paziente utilizzando vettori di virus Sendai non integrati. Quindi descriviamo in dettaglio un piccolo metodo di differenziazione monostrato mediato da molecole che può produrre in modo robusto cardiomiociti battenti dalla maggior parte delle linee iPSC umane. Inoltre, viene introdotto un protocollo di espansione dei cardiomiociti scalabile utilizzando una piccola molecola (CHIR99021) che potrebbe espandere rapidamente i cardiomiociti derivati dal paziente per applicazioni di livello industriale e clinico. Alla fine, vengono illustrati protocolli dettagliati per l'identificazione molecolare e la caratterizzazione elettrofisiologica di questi iPSC-CM. Ci aspettiamo che questo protocollo sia pragmatico per i principianti con conoscenze limitate sullo sviluppo cardiovascolare e sulla biologia delle cellule staminali.
Introduzione
La scoperta di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo ha rivoluzionato la moderna medicina cardiovascolare1,2. Le iPSC umane sono in grado di auto-rinnovarsi e generare tutti i tipi di cellule nel cuore, compresi cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e fibroblasti cardiaci. I cardiomiociti derivati da iPSC del paziente (iPSC-CM) possono servire come risorse indefinite per modellare le malattie cardiovascolari geneticamente ereditabili (CVD) e testare la sicurezza cardiaca per i nuovi farmaci3. In particolare, i pazienti iPSC-CM sono ben pronti a studiare ....
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Protocollo
I protocolli sperimentali e il consenso informato per i soggetti umani sono stati approvati dall'Institutional Review Board (IRB) presso il Nationwide Children's Hospital.
1. Preparazione di terreni di coltura cellulare, soluzioni e reagenti
- Preparare i supporti PBMC
- Mescolare 20 mL di terreno di coltura PBMC basale (1x) e 0,52 mL di integratore. Aggiungere 20 μL di SCF e FLT3 ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL), 4 μL di IL3, IL6 ed EPO ciascuno (concentrazione di stock: 100 μg/mL) e 200 μL di alternativa L-glutammina (100x). Mescolarli accuratamente. Filtrare in una cappa sterile utilizzando un'unità filtrante d....
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Risultati
Riprogrammazione iPSC umana da PBMC
Dopo la pre-coltura con Complete Blood Media per 7 giorni, le PBMC diventano grandi con nuclei visibili e citoplasma (Figura 1B), indicando che sono pronte per la trasfezione del virus. Dopo la trasfezione con i fattori di riprogrammazione del virus Sendai, i PBMC saranno sottoposti a un processo di riprogrammazione epigenetica per un'altra settimana. In genere, otteniamo 30-50 colonie di iPSC dalla tras.......
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Discussione
Durante la riprogrammazione iPSC, è fondamentale coltivare PBMC per 1 settimana fino a quando non vengono ingranditi con nuclei chiari e citoplasma. Poiché i PBMC non proliferano, un numero di cellule appropriato per la trasduzione virale è importante per una riprogrammazione iPSC di successo. Il numero di cellule pbMC, la molteplicità dell'infezione (MOI) e il titolo del virus devono essere considerati e regolati per raggiungere i risultati di trasduzione ottimali. Per la differenziazione cardiaca, la densità iniziale d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dall'American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) sovvenzioni 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Il Dr. Ming-Tao Zhao è stato anche supportato da fondi di avvio dell'Abigail Wexner Research Institute presso il Nationwide Children's Hospital.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Sistema di PCR veloce in tempo reale | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Amplificatore di microelettrodi | Molecular Devices | Integratore di microelettrodi | |
| B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| integratore di B27 senza insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit di fissaggio/permeabilizzazione | BD Biosciences | 554714 | Soluzione di fissaggio/permeabilizzazione, tampone di perm/lavaggio |
| BD Vacutainer Tubo CPT | BD Biosciences | 362753 | Tubo di separazione delle cellule del sangue |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Kit di riprogrammazione Sendai | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Kit di riprogrammazione del virus Sendai |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Scheda di acquisizione | |
| Kit Miniprep RNA Direct-zol Kit | estrazione RNA | Zymo Research | R2050 |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 terreni | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 per colture iPSC |
| Integratore GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 Alternativa alla | L-glutammina |
| Fattore di crescita ridotto Matrigel | Corning | 356231 | Matrice della membrana basale |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | sintesi di cDNA |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices Software | l'acquisizione e l'analisi dei dati di elettrofisiologia | |
| EPO umano ricombinante | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Umano ricombinante FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| IL3 umano ricombinante | Peprotech | 200-03 | |
| IL6 umano ricombinante | Thermo Fisher Scientific | ||
| Umano ricombinante SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medio | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medio, senza glucosio | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Terreno di montaggio |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | terreni di coltura PBMC |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | soluzione di dissociazione CM |
| UltraPure 0,5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | soluzione di dissociazione iPSC |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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Ristampe e permessi
