Articolo metodologico

Flusso di lavoro e strumenti per lo screening dei frammenti cristallografici presso l'Helmholtz-Zentrum di Berlino

DOI:

10.3791/62208

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3 marzo 2021

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1Macromolecular Crystallography, Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Structural Biochemistry Group, Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 3BioMAX, MAX IV Laboratory, 4Drug Design Group, Institute of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-Universität Marburg, 5Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

In questo articolo

Sommario

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Lo screening dei frammenti cristallografici presso helmholtz-Zentrum Berlin viene eseguito utilizzando un flusso di lavoro con librerie composte dedicate, strumenti di gestione dei cristalli, strutture di raccolta rapida dei dati e analisi dei dati ampiamente automatizzata. Il protocollo presentato intende massimizzare l'output di tali esperimenti per fornire punti di partenza promettenti per la progettazione di ligandi basati su strutture a valle.

Abstract

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Lo screening dei frammenti è una tecnica che aiuta a identificare punti di partenza promettenti per la progettazione del ligando. Dato che i cristalli della proteina bersaglio sono disponibili e mostrano proprietà di diffrazione a raggi X riproducibilmente ad alta risoluzione, la cristallografia è tra i metodi più preferiti per lo screening dei frammenti a causa della sua sensibilità. Inoltre, è l'unico metodo che fornisce informazioni 3D dettagliate sulla modalità di associazione del frammento, che è vitale per la successiva evoluzione razionale del composto. L'uso di routine del metodo dipende dalla disponibilità di librerie di frammenti adatte, mezzi dedicati per gestire un gran numero di campioni, travi di sincrotrone all'avanguardia per misurazioni rapide della diffrazione e soluzioni ampiamente automatizzate per l'analisi dei risultati.

Qui vengono presentati il flusso di lavoro pratico completo e gli strumenti inclusi su come condurre lo screening dei frammenti cristallografici (CFS) presso l'Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Prima di questo flusso di lavoro, le condizioni di ammollo cristallino e le strategie di raccolta dei dati sono ottimizzate per esperimenti cristallografici riproducibili. Quindi, in genere in una procedura di uno o due giorni, viene utilizzata una libreria focalizzata sul CFS da 96 membri fornita come piastre pronte all'uso essiccate per immergere 192 cristalli, che vengono poi raffreddati a flash individualmente. Gli esperimenti finali di diffrazione possono essere eseguiti entro un giorno presso le linee di fascio supportate bl14.1 e BL14.2 del BESSY II azionate dall'HZB a Berlino-Adlershof (Germania). L'elaborazione dei dati cristallografici, il perfezionamento delle strutture proteiche e l'identificazione degli hit sono veloci e in gran parte automatizzati utilizzando pipeline software specializzate su server dedicati, che richiedono poco input da parte dell'utente.

L'utilizzo del flusso di lavoro CFS all'HZB consente esperimenti di screening di routine. Aumenta le possibilità di identificare con successo i frammenti come punti di partenza per sviluppare leganti più potenti, utili per applicazioni farmacologiche o biochimiche.

Introduzione

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Il primo passo nello sviluppo di farmaci è lo screening dei composti rispetto a un bersaglio di interesse. Tradizionalmente, le grandi librerie composte dell'ordine di 100.000-1.000.000 di voci sono utilizzate in saggi biochimici ad alta produttività nell'industria farmaceutica. Questa strategia è stata integrata dalla progettazione di farmaci basati su frammenti (FBDD), un metodo più nuovo che ha preso un forte aumento negli ultimi 20 anni ed è diventato una strategia mainstream per generare candidati di piombo di alta qualità a causa di diversi vantaggi intrinseci delmetodo 1. Il termine "frammento" si riferisce a una piccola molecola organica contenente tipicamente meno di 20 atomi non idrogeno o pesanti (HA). Pertanto, un frammento è significativamente più piccolo delle molecole simili a farmaci o piombo (di solito meno di 30 HA) esplorate nello screening convenzionale ad alta produttività. I frammenti sono raccoglitori di affinità debole. Tuttavia, rispetto alle molecole più grandi, i frammenti sono più versatili, poiché anche una piccola collezione di essi può rappresentare meglio il rispettivo spazio chimico di molecole della stessa dimensione2. Inoltre, l'evoluzione degli screening dei frammenti nelle molecole di piombo è considerevolmente più efficace rispetto all'ottimizzazione di molecole già più grandi2,3,4,5. Ciò significa che, in attesa di una sufficiente sensibilità del rilevamento, lo screening dei frammenti può essere utilizzato in modo efficiente e produce punti di partenza di alta qualità per un'ulteriore evoluzione composta. Diversi metodi biofisici possono essere applicati per lo screening dei frammenti, il più popolare dei quali è la risonanza magnetica nucleare, la cristallografia a raggi X, la risonanza plasmonica di superficie e i test di spostamento termico. Questi metodi sono usati in modo parallelo o sequenziale, con l'obiettivo di aumentare la fiducia nei colpi e ridurre il numero di falsi positivi o falsi negativi, rispettivamente. Tuttavia, uno studio comparativocondotto di recente 6 ha suggerito di evitare cascate di screening sequenziali a causa della bassa sovrapposizione tra i diversi metodi.

La cristallografia a raggi X è un metodo ben consolidato per la determinazione della struttura nei dettagli atomici, ma è stato recentemente sviluppato anche come strumento a scopo di screening7,8. Poiché i cristalli proteici tollerano alte concentrazioni di frammenti (ad esempio, 100 mM), lo screening dei frammenti cristallografici (CFS) può competere con altri metodi biofisici per lo screening dei frammenti o addirittura sovraperformare come metodo di screening del primo passo6,9. Tuttavia, un prerequisito vitale per il CFS è un sistema di cristallizzazione convalidato della proteina bersaglio che fornisce riproducibilmente cristalli con proprietà di diffrazione a una risoluzione notevolmente elevata, in genere migliore di 2 Å.

Un vantaggio esclusivo del CFS rispetto a tutte le altre metodologie di screening dei frammenti è la fornitura di informazioni 3D dettagliate sulla modalità di associazione dei frammenti identificati. Queste informazioni strutturali sono assolutamente cruciali per l'ottimizzazione razionale dei colpi del frammento ai raccoglitori ad alta affinità. Le strategie di elaborazione consolidate stanno crescendo, fondendo e collegando i frammenti colpi5. In tal modo viene fornita fin dall'inizio un'efficienza ligando relativamente elevata e si può evitare l'introduzione di gruppi non necessari o spazialmente non adatti, riducendo così i costi di sintesi chimica. Tutto nel complesso, CFS ha vantaggi impareggiati come strategia di partenza per la progettazione di farmaci.

Dato che un particolare obiettivo biologico soddisfa gli elevati requisiti del CFS per quanto riguarda la qualità cristallina, ci sono alcuni fattori principali che massimizzano le possibilità di un esito positivo di tali campagne di screening. Dipende dalla qualità della libreria di frammenti utilizzata, da un flusso di lavoro efficiente per effettuare gli esperimenti prima dell'esperimento di diffrazione, dalle travi del sincrotrone con sufficiente automazione e velocità di raccolta dei dati, nonché dai modi e dai mezzi per l'elaborazione e l'analisi dei dati ampiamente automatizzate. Qui viene presentato il flusso di lavoro completo dagli esperimenti di ammollo cristallino all'identificazione del colpo, nel modo in cui viene stabilito con successo sulle travi di cristallografia macromolecolare di BESSY II (Figura 1). La struttura è aperta agli utenti accademici e industriali per la collaborazione. Inoltre, gli utenti accademici dei paesi dell'UE al di fuori della Germania possono richiedere facilmente finanziamenti tramite il progetto iNEXT Discovery.

Ci sono prerequisiti indispensabili per poter avviare una campagna CFS e condurre il protocollo delineato in questo lavoro: sono disponibili cristalli ben diffratti della proteina target che possono essere coltivati in modo riproducibile in gran numero, che sono stabili a temperatura ambiente e che sono stati coltivati utilizzando un cocktail di cristallizzazione senza ingredienti altamente volatili. Un altro prerequisito è l'idoneità del reticolo cristallino per l'esperimento. In un reticolo appropriato, i siti interessanti della proteina bersaglio devono essere esposti verso i canali del solvente e quindi accessibili. Un altro passaggio precedente che è facoltativo ma comunque altamente raccomandato per garantire il successo nel flusso di lavoro della campagna CFS è l'ottimizzazione della condizione di ammollo per l'esperimento. Le statistiche di benchmark vitali qui sono il potere di diffrazione del cristallo e i relativi indicatori di qualità dei dati, che vengono determinati durante la procedura di ridimensionamento dei dati. I fattori tipici da ottimizzare sono la tolleranza DMSO, la concentrazione del tampone e il crio-protettore. Sebbene non sia un prerequisito rigoroso come ulteriormente dettagliato di seguito, DMSO come co-solvente può aiutare ad aumentare la solubilizzazione dei frammenti. I test tipici dovrebbero includere l'ammollo di DMSO 0, 3, 6 o 10% (v/v) durante la notte. Un aumento della concentrazione tampone a 200 o 300 mM aiuta a prevenire la perdita di qualità della diffrazione a causa di effetti occasionali di spostamento del pH derivanti dalle elevate concentrazioni di frammenti da utilizzare. Infine, è decisivo scoprire se e quale crioprotettivo aggiuntivo è richiesto e se può essere già incluso nella condizione di ammollo. In molti casi, tuttavia, non è necessario un ulteriore crio-protettore, perché la stessa DMSO può agire come un crio-protettore. In tal caso, ciò salverà un passaggio di gestione nell'esperimento finale. La maggior parte dei cristalli ha bisogno di meno crio-protettore se raffreddato a flash su anelli di dimensioni appropriato, riducendo al minimo o evitando il più possibile il liquore madre circostante. Tuttavia, in rari casi, uno strato del liquore madre è effettivamente necessario per prevenire danni al cristallo al raffreddamento flash.

Il numero di colpi ottenuti in una campagna CFS non dipende solo dalla farmacogobilità della proteina bersaglio e dall'idoneità del reticolo cristallino (vedi sopra), ma dipende anche dalla qualità della libreria. La qualità della biblioteca comprende due aspetti: la selezione dei composti per la biblioteca e la fezione dei composti (cioè, in quale forma fisica sono presentati per l'esperimento). Per la selezione composta possono essere utilizzate diverse strategie. La maggior parte dei progetti di biblioteche includono la massimizzazione della diversità chimica dei frammenti. Un obiettivo strategico potrebbe essere quello di includere la trattabilità chimica dei frammenti per la progettazione di follow-up, che è stata applicata ad esempio nella libreria in bilico Diamond-SGC-iNEXT10. Un altro obiettivo strategico per la progettazione della biblioteca potrebbe essere quello di massimizzare la rappresentazione dello spazio chimico disponibile in commercio dei frammenti mediante clustering basato su forma e farmacoforo, come esemplificato dalle librerie F2X sviluppate a HZB11. Più specificamente, sono stati sviluppati la libreria F2X-Universal con 1103 membri e il sottoinsieme rappresentativo composto 96 per le campagne CFS iniziali, che si chiama F2X-Entry Screen, e la schermata F2X-Entry è stata convalidata con successo11. La schermata F2X-Entry è la scelta principale per le campagne CFS su HZB. Successivamente, campagne più grandi possono quindi essere condotte utilizzando la F2X-Universal Library o la libreria di frammenti EU-OPENSCREEN12, membro di 1056 membri, che viene offerta anche all'HZB. Attualmente, queste biblioteche sono disponibili gratuitamente per gli utenti delle linee di telegrafia macromolecolare del sincrotrone BESSY II di Berlino sulla base di un contratto di collaborazione. Questo vale anche per gli utenti tramite le proposte iNEXT Discovery. Inoltre, la schermata F2X-Entry è disponibile per tutti gli scienziati interessati sulla base di un accordo di trasferimento di materiale.

Per quanto riguarda la presentazione fisica di una biblioteca, vengono comunemente adottati due approcci: i frammenti sono utilizzati come soluzioni stock DMSO o i frammenti vengono essiccati e immobilizzati su piastre pronte all'uso. A HZB, sia l'F2X-Entry Screen che i composti non volatili della F2X-Universal Library sono presentati come composti essiccati in una piastra di cristallizzazione MRC a 3 lenti da 96 po '. La presentazione dei frammenti immobilizzati in piastre di cristallizzazione ha due vantaggi vitali: in primo luogo, consente il trasporto delle piastre di screening al laboratorio di casa dell'utente. Pertanto, le fasi di ammollo e movimentazione dei cristalli del flusso di lavoro qui presentate (passaggi 1-3) possono essere eseguite ovunque. In secondo luogo, è possibile utilizzare una soluzione priva di DMSO. Gli obiettivi sensibili alla DMSO possono quindi essere schermati facilmente, mantenendo in gran parte i tassi di hitprevisti 11. Tuttavia, dmso aumenta la solubilità dei frammenti, quindi vale la pena controllare la tolleranza DMSO di un sistema cristallino di scelta in anticipo come sopra descritto.

Il protocollo descritto di seguito descriverà un tipico esperimento con uno schermo composto da 96 come la schermata di ingresso F2X. Per questo, circa 250 cristalli devono essere preparati in tempo per essere utilizzati al momento. Si consiglia vivamente di preparare gli ammollo per tutti i 96 composti in duplicato. Si consiglia, ma facoltativo, di preparare ulteriori mock-soak che aiuteranno in seguito con l'analisi dei dati utilizzando l'approccio PanDDA (PanDDA) per l'identificazione dei colpi13. I mock-soak sono definiti come esperimenti di ammollo su cristalli proteici utilizzando la stessa soluzione di ammollo degli ammollo dei frammenti per lo stesso tempo di incubazione, ma non sono presenti frammenti. Se la soluzione di ammollo è uguale alla condizione di cristallizzazione, i cristalli possono essere raccolti direttamente dalla piastra di cristallizzazione.

A seconda delle capacità del cambio di campione robotico, potrebbero essere necessario utilizzare diversi formati di disco. Al momento, i campioni per la beamline BL14.1 azionata da HZB devono essere preparati in formato Unipuck, i campioni per la beamline BL14.2 azionata da HZB devono essere preparati in formato spine puck. In questo protocollo viene assunta la preparazione in formato Unipuck.

Protocollo

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1. Cristalli ammollo

  1. Prendere la piastra di vagliatura (qui, una piastra F2X-Entry Screen, Figura 2) dal congelatore -20 °C e posizionarla sul banco / tavolo per circa 30 minuti per prerifarlo a temperatura ambiente, evitando così l'umidità di condensa.
  2. Disporre il posto di lavoro con due microscopi strettamente disposti e tutti gli strumenti necessari(figura 3A). I materiali sono elencati nella tabella dei materiali.
  3. Scegli 3-4 anelli della dimensione appropriata per il trasferimento dei cristalli da immergere e posizionali vicino ai microscopi.
  4. Riempire le cavità della piastra spot in vetro con acqua deionizzata o distillata.
  5. Preparare 5 mL di soluzione di ammollo.
  6. Aprire il sacchetto della piastra di vagliatura preri riscaldato a temperatura ambiente.
  7. Rimuovere il coperchio e il foglio dalla piastra di vagliatura, mantenendo la piastra posizionata sulla panca/tavolo.
  8. Decantare i 5 mL di soluzione di ammollo nel serbatoio del reagente.
  9. Riempire ciascuno dei 96 serbatoi con 40 μL di soluzione di ammollo utilizzando la pipetta a 12 canali.
  10. Posizionare il telaio EasyAccess sopra la piastra di vagliatura e fissarlo con i morsetti inclusi facendoli scorrere sul lato sinistro e destro del dispositivo.
    NOTA: EasyAccess Frame è un dispositivo speciale per la gestione di più cristalli, sviluppato all'HZB14. Consente un facile accesso a ciascun pozzo spostando le piastrelle mobili proteggendo al contempo gli altri pozzi dall'evaporazione.
  11. Posizionare la piastra di vagliatura (incluso il telaio EasyAccess) al primo microscopio e la piastra di cristallizzazione, compresi i cristalli da immergere al secondo microscopio.
  12. Aprire bene A1 della piastra di vagliatura spostando la rispettiva piastrella di vetro acrilico del telaio EasyAccess con un dito o lo strumento penna in dotazione.
  13. Aggiungere 0,4 μL di soluzione di ammollo dal serbatoio al frammento contenente bene (lente in alto a sinistra) utilizzando una punta di pipetta fresca. Controlla attraverso il microscopio che la goccia copra il frammento essiccato, in modo che possa dissolversi.
    NOTA: in alternativa, questo passaggio può essere eseguito utilizzando un robot pipettante prima dell'assemblaggio del frame EasyAccess. In questo modo le gocce di ammollo di tutti i pozzi potrebbero essere collocate in un'unica procedura automatica. Tuttavia, gli autori raccomandano di aggiungere la soluzione di ammollo direttamente prima della fase di ammollo come descritto per garantire che il frammento si solubilizzi lentamente e in presenza del cristallo. Ciò evita che il cristallo si sottosciti un improvviso shock al momento del trasferimento in una goccia con un'alta concentrazione di frammenti.
  14. Al secondo microscopio, aprire il foglio di tenuta della piastra di cristallizzazione in uno dei pozzi che contiene i cristalli bersaglio.
  15. Trasferire due cristalli utilizzando un anello di dimensioni appropriato montato sulla bacchetta di cristallo sul pozzo A1 della piastra di vagliatura al primo microscopio.
  16. Lavare l'anello nella piastra spot di vetro preparata e asciugarlo toccando delicatamente il tessuto. Fallo dopo ogni trasferimento per evitare la contaminazione incrociata con frammenti contenenti soluzioni di ammollo.
  17. Utilizzare il microscopio per verificare che i cristalli siano stati posizionati correttamente.
  18. Passare al pozzo successivo (ad esempio, B1).
  19. Ripetere i passaggi 1.13-1.18 con tutti i 96 pozzali della piastra di vagliatura fino a quando ogni goccia di ammollo contiene due cristalli.
  20. Rimuovere la piastra di vagliatura (incluso il telaio EasyAccess) dal microscopio e posizionarla sul banco/tavolo.
  21. Rimuovere il frame EasyAccess dalla piastra di screening.
  22. Sigillare la piastra di vagliatura con un foglio di tenuta e posizionarla rispettivamente nell'incubatore di cristallizzazione o nell'armadio, dove sono stati coltivati i cristalli.
  23. Incubare per il tempo di ammollo ottimizzato. La notte è di solito conveniente.
  24. (facoltativo) Preparazione di circa 40 cristalli di apo (cioè, finto ammollo)
    1. Prendi una piastra di cristallizzazione mrc a 3 lenti a 96 po', a basso profilo, e riempi due colonne con 40 μL di soluzione di ammollo per pozzo utilizzando la pipetta a 12 canali.
    2. Posizionare il telaio EasyAccess sopra la piastra di cristallizzazione e fissarlo con i morsetti inclusi facendoli scorrere sul lato sinistro e destro del dispositivo.
    3. Aprire la piastrella di vetro acrilico del pozzo A1.
    4. Posizionare 0,4 μL di soluzione di ammollo in ciascuna delle due lenti sinistra del pozzo.
    5. Trasferire 2-3 cristalli ad ogni goccia. Dopo ogni trasferimento, lavare l'anello nella piastra di vetro preparata e asciugare toccando delicatamente il tessuto.
    6. Passare al pozzo successivo (ad esempio, B1).
    7. Ripetere i passaggi 1.24.4-1.24.6 fino a quando circa 40 cristalli sono pronti per l'incubazione.
    8. Rimuovere la piastra di cristallizzazione (incluso EasyAccess Frame) dal microscopio sul banco/tavolo e rimuovere il telaio EasyAccess.
    9. Sigillare la piastra di cristallizzazione con un foglio di tenuta e posizionarla nel suddetto incubatore di cristallizzazione o armadio.
    10. Incubare per lo stesso tempo della piastra di screening.

2.Cristalli di raccolta

  1. Estraere le piastre di incubazione dall'incubatrice o dall'armadio, rispettivamente.
  2. Disporre il posto di lavoro con un microscopio e tutti gli strumenti necessari (Figura 3B). I materiali sono elencati nella tabella dei materiali.
  3. Preparare un dewar in schiuma Unipuck con 3 coperchi Unipuck (ad esempio, involucri campione) e riempirlo con azoto liquido (LN2).
    NOTA: Osservare le precauzioni di sicurezza appropriate per lavorare con LN2 (ad esempio, indossare occhiali di sicurezza e utilizzare dispositivi di protezione adeguati). È meglio ottenere LN2 fresco più volte durante la sessione al fine di evitare la condensa dell'acqua nella laccheraggio di stoccaggio LN2. Attraverso l'intera procedura seguente, assicurarsi che il livello LN2 nel dewar in schiuma raggiunga sempre il bordo superiore del dewar. Assicurarsi inoltre che l'LN2 sia privo di ghiaccio; sostituire frequentemente l'LN2 (ad esempio, una volta ogni 45 minuti), o più tardi se il ghiaccio inizia ad accumularsi. Quindi, riempire la seconda schiuma dewar e trasferire Unipucks ad esso. Svuotare la schiuma ghiacciata dewar e rimuovere il ghiaccio residuo e l'umidità con l'asciugacapelli.
  4. Rimuovere il foglio dalla piastra di vagliatura e posizionare il telaio EasyAccess in alto.
  5. Aprire bene A1.
  6. Raccogliere due cristalli dalla goccia e raffreddarli flash in LN2 (uno per uno) immergendosi con un rapido movimento verticale nell'LN2 e quindi inserendo il campione nella giusta posizione del disco. Prendere appunti pertinenti nella scheda di tracciamento del campione.
  7. Fase di crioprotezione (se necessario per i cristalli bersaglio). In tal caso, eseguire questo passaggio anziché 2.6.
    1. Posizionare 0,4 μL di soluzione di ammollo, incluso il crio-protettore sulla lente in basso a sinistra del pozzo.
    2. Tirare l'anello con un cristallo montato dalla caduta nell'obiettivo in alto a sinistra lentamente attraverso la soluzione nell'obiettivo in basso a sinistra mantenendo il cristallo nel loop, quindi flash-cool in LN2. Raccogli due cristalli in questo modo.
      NOTA: Nei passaggi 2.6 e 2.7, assicurarsi che il tempo in cui il cristallo è nel loop ed esposto all'aria sia mantenuto molto breve. Il tuffo (cioè la caduta verticale del campione nel dewar riempito con LN2)deve essere eseguito il più velocemente possibile. Ciò garantisce un'elevata qualità del campione e la prevenzione degli anelli di ghiaccio nei dati. Tenere traccia dei campioni (ad esempio, notare se i cristalli hanno danni, ecc.) per dare la priorità a entrambi i duplicati per le seguenti misurazioni a raggi X, utilizzare il modello per questo. Anche se i cristalli hanno crepe, "peli" o altri difetti dovuti all'ammollo, possono comunque essere utilizzati e devono sempre essere raccolti. Nel caso in cui i cristalli si siano spezzati in diversi pezzi, due dei pezzi più grandi / più bello dovrebbero essere raccolti. La figura 5 mostra alcuni esempi di come possono essere tali cristalli. Tutti i cristalli mostrati hanno dato set di dati ancora utili nella rispettiva campagna11,sottolineando che vale la pena raccogliere cristalli dopo il trattamento di ammollo, anche se si sono verificati cambiamenti morfologici sostanziali.
  8. Vai al pozzo successivo e ripeti i passaggi da 2,5 a 2,6./2.7 fino a quando tutti e tre i dischi sono riempiti.
  9. Aggiungere le basi Unipuck sopra i coperchi dopo averle preraffreddate in LN2.
  10. Conservare le unipucks nei rack di stoccaggio in un dewar di trasporto o in un deposito dewar.
  11. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i pozzi della piastra di vagliatura non sono stati elaborati.
  12. (facoltativo) Se sono stati preparati cristalli finti imbevuti, raccoglierli in modo simile a quanto descritto in precedenza.
    NOTA: Se due cristalli per ciascuna delle 96 condizioni della piastra di vagliatura potrebbero essere raffreddati a flash, ci sarà spazio per 32 cristalli di apo imbevuti di beffardo, per riempire le 14 Unipucks.
  13. Conservare le disconquisizioni in LN2 fino alla misurazione.

3.Raccolta dati

  1. Trasferire le discone sulla linea di travi BL14.1. Se i dischi SPINE sono stati utilizzati nel passaggio 2, trasferirli sulla linea di travi BL14.2.
  2. Effettuare misurazioni standard sulla linea di fascio utilizzando le raccomandazioni specifiche riportate di seguito. I dettagli sulla struttura e sul programma di controllo degli esperimenti MXCuBE2 sono stati presentati inprecedenza 15,16. La figura 4 mostra l'interno degli hutches sperimentali delle travi BL14.1 e BL14.2, nonché uno screenshot di esempio del software di controllo MXCuBE2 sulla linea di fascio BL14.1.
    1. Per massimizzare l'efficienza e la velocità effettiva del tempo, salta la raccolta di immagini di test. La distanza da campione a rivelatore sarà fissata a un valore adatto al limite di risoluzione superiore del sistema cristallino determinato in esperimenti precedenti. Se la strategia di raccolta dei dati non è stata ottimizzata in anticipo, raccogliere 1800 immagini di 0,2 gradi ciascuna con un tempo di esposizione di 0,1 s per immagine.
    2. Idealmente, testa la strategia di raccolta dei dati in esperimenti precedenti utilizzando cristalli di apo finti imbevuti. Per gruppi di spazio di simmetria più elevati, 1200 immagini o anche 900 immagini (rispettivamente 240° o 180°) forniranno già set di dati completi con buone statistiche, indipendentemente dall'angolo iniziale di raccolta dei dati.
      NOTA: una maggiore ridondanza e un'affezione più fine possono produrre una qualità dei datisuperiore 17. Tuttavia, l'utilizzo di questa strategia "sufficiente ma non di più" proposta qui è un eccellente compromesso tra qualità, tempo di raccolta dei dati e requisiti computazionali per l'analisi in seguito. Nel modo descritto, 200 raccolte di dati in 24 ore sono ben possibili sulle travi BL14.1 e BL14.2. Tuttavia, i campioni devono avere la priorità.
    3. Raccogliere innanzitutto set di dati di diffrazione per un campione per condizione di frammento, in base alla definizione delle priorità nel passaggio 2.6./2.7 (ad esempio, raccogliere i dati per il duplicato con priorità più alta).
    4. Per gli esperimenti di cui al punto 3.2.3 in cui la raccolta dei dati non è riuscita, si è persa la diffrazione o si sono verificati gravi anelli di ghiaccio, raccogliere dati per il secondo campione duplicato della rispettiva condizione del frammento.
    5. Raccogliere set di dati di diffrazione di cristalli di apo (se preparati secondo i passaggi 1.24 e 2.12).
    6. Raccogliere i set di dati di diffrazione dei duplicati rimanenti di ogni condizione di frammento.
    7. Nel programma MXCuBE2, abbinare gli identificatori di set di dati di una campagna CFS al modello seguente: --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (ad esempio, MyProtein-F2XEntry-B05a, dove "B05" sta per il pozzo (cioè la condizione del frammento nello schermo) e la seguente "a" per il primo duplicato.)

4.Trattamento dei dati

  1. Per l'analisi dei dati della campagna CFS, utilizzare FragMAXapp, una soluzione basata sul web per controllare un'analisi multiplex per l'elaborazione dell'auto-perfezionamento e la valutazione dei colpi PanDDA dei dati CFS18 (Lima et al. FragMAXapp, dati inediti). Nella versione FragMAXapp distribuita a HZB sono disponibili i seguenti programmi/pipeline: XDSAPP19, Xia2-DIALS e Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, Phenix LigFit22, PanDDA13,23. Utilizzare un modello di input ben raffinato della proteina target come input per la raffinatezza automatica; altrimenti eseguire un meticoloso perfezionamento di un cristallo finto ad alta risoluzione che è stato raccolto durante la campagna.
    NOTA: un elemento chiave per l'identificazione degli hit è PanDDA. I dettagli sono spiegati nelle rispettivepubblicazioni 13,23. In breve, PanDDA calcola automaticamente le mappe di densità elettronica di un insieme di set di dati in una campagna CFS. Questi vengono quindi assunti come condizioni di frammento non vincolanti e mediati per generare il cosiddetto modello dello stato di terra. Il modello dello stato del suolo viene quindi utilizzato per derivare discrepanze locali tra ogni mappa di densità elettronica e la mappa dello stato del suolo, usando punteggi Z associati al voxel. Quindi, per le aree con punteggi Z alti, una cosiddetta mappa PanDDA viene creata dalla sottrazione ottimizzata della densità dello stato del suolo dalla rispettiva mappa. Ciò migliora in gran parte la visibilità degli eventi di associazione dei frammenti.
  2. Per massimizzare il risultato di PanDDA, utilizzare un approccio in due tempi. In primo luogo, eseguire un'esecuzione PanDDA (pandda.analyse) con impostazioni standard. Anche se sono stati raccolti cristalli imbevuti di beffa, la loro identità non sarà inclusa come parametro (il che è comunque possibile) al fine di consentire una generazione imparziale del modello dello stato del suolo da parte di PanDDA da tutti i dati disponibili. Successivamente, i dati di output vengono valutati dall'utente tramite una cosiddetta ispezione PanDDA nella folaga24. Qui, si noterà un riscontro con fiducia relativamente elevata, concludendo il primo passo.
  3. In secondo luogo, ri eseguire di nuovo il passaggio pandda.analyse escludendo i risultati preliminari (determinati nel primo passaggio) dal modello dello stato fondamentale tramite l'opzione della riga di comando --exclude_from_characterisation="". Ulteriori dettagli sono descritti nelle pagine della Guida di PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). In questo modo, i set di dati che sono colpi chiari e quindi oscurerebbe il modello dello stato di base se inclusi vengono ignorati. Ciò porta a un migliore modello dello stato del suolo e quindi a risultati complessivamente migliorati. Infine, viene eseguita un'accurata ispezione PanDDA per completare l'identificazione del colpo.
    NOTA: FragMAXapp include anche un'opzione di output per salvare gli stati associati modellati o preparare i dati per l'invio pdb, per ulteriori dettagli vedi pagine Web FragMAX (https://fragmax.github.io/).

Risultati

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Come parte delle campagne di convalida precedentemente riportate dell'F2X-Entry Screen11,sono state condotte tre campagne presso la linea di fascio BioMAX a MAX IV e una campagna è stata condotta alla beamline BL14.1 a HZB. In quest'ultima campagna, un particolare set di condizioni F2X-Entry Screen utilizzando una condizione di ammollo che non conteneva DMSO è stato proiettato contro il complesso proteina-proteina del lievito Aar2 e il dominio simile alla RNasiH del lievito Prp8 (AR). Il set di condizioni selezionato comprende i successi che sono stati trovati in una precedente campagna della schermata F2X-Entry contro l'AR in una condizione di ammollo contenente DMSO11, (cioè, nella campagna eseguita a HZB tali colpi sono stati ri-schermati in assenza di DMSO). La figura 7 mostra una panoramica degli hit ottenuti dopo aver analizzato i dati con la combinazione FragMAXapp di XDSAPP per l'elaborazione, fspipeline per l'auto-perfezionamento e successiva hit finding utilizzando PanDDA.

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Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro di un esperimento di screening dei frammenti cristallografici (CFS) con particolare attenzione all'ambiente speciale presso helmholtz-zentrum berlinese. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

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Figura 2: Formulazione e confezionamento della schermata di immissione F2X. Lo schermo composto 96 è disponibile su una piastra mrc a 3 lenti a 96 pompate a basso profilo, sigillata con lamina e confezionata sottovuoto. I 96 composti dello schermo vengono essiccati da soluzioni DMSO in due delle tre lenti di ogni pozzo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Fotografia del gruppo di lavoro CFS nel laboratorio di preparazione HZB. Vengono visualizzati i gruppi di utensili necessariper l'ammollo A ) e per la raccolta del cristallo B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Stazioni finali di raccolta dati e software di controllo. A) Fotografia dell'hutch sperimentale delle travi HZB-MX BL14.1 (sinistra) e BL14.2 (destra)15. B) Screenshot dell'interfaccia di controllo dell'esperimento MXCuBE216 utilizzata in BL14.1 per la raccolta dei dati di diffrazione. A BL14.2 viene utilizzata un'interfaccia molto simile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  

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Figura 5: Istantanee fotografiche di alcuni campioni cristallini in ambiente criogenico prima della raccolta dei dati. Ciò illustra la variabilità delle morfologie dei cristalli dopo aver eseguito l'ammollo dei frammenti e la raccolta del cristallo. Le fotografie sono state scattate sulla linea di fascio BioMAX (max IV synchrotron, Lund, Svezia) per campioni AR raccolti lì come parte della convalida F2X-Entry Screen11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Screenshot del FragMaxApp18 installato all'HZB per una comoda analisi dei dati. Maggiori dettagli a Lima et al., FragMAXapp, dati inediti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Panoramica dei risultati della campagna CFS F2X-Entry vs AR (senza DMSO). Il complesso proteico AR è mostrato in vista cartoon, con Aar2 colorato in grigio e il dominio simile alla RNasiH di Prp8 colorato di blu. I frammenti della campagna sono colorati in colori degli elementi (C - giallo, O - rosso, N - blu, S - arancione, Cl - ciano chiaro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussione

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Per una campagna CFS di successo, è fondamentale attenersi ai prerequisiti descritti (vedere Introduzione). È necessario un sistema di cristallizzazione affidabile per la crescita riproducibile di molti cristalli ben diffratti, ed è necessaria una struttura ben raffinata come modello apo di input per la raffinatezza automatizzata. È anche importante verificare che il sito di destinazione sulla proteina (sito attivo, o area di interfaccia) sia accessibile per frammenti nel reticolo cristallino. È fondamentale ottimizzare in anticipo le condizioni di ammollo per garantire che l'ammollo non deteriori significativamente la qualità del cristallo. Trascurare questi aspetti porterà molto probabilmente ad un esperimento non ottimale, che sarà di uso limitato e, nel peggiore dei casi, richiederà una ripetizione dell'intero esperimento.

Il protocollo sopra descritto delinea le procedure seguite durante una campagna CFS standard. Se tutti i prerequisiti sono soddisfatti, almeno il 90% di tutti i cristalli imbevuti dovrebbe mostrare diffrazione ad alta risoluzione in un esperimento di diffrazione. In caso contrario, i tempi di ammollo possono essere abbreviati in poche ore o addirittura minuti. A causa della buona solubilità della maggior parte dei frammenti, questo dovrebbe essere sufficiente per ottenere valori di occupazione decenti. Inoltre, una tipica campagna CFS si tradurrà in un tasso di successo di circa il 10% o superiore. Per le campagne di convalida F2X-Entry Screen11 e le campagne utente in corso con la stessa libreria sono stati osservati tassi di successo ancora più elevati (20% e oltre, dati non visualizzati).

Un avvertimento generale dello screening dei frammenti cristallografici è la presenza di siti di contatto cristallografici. Questi potrebbero occluire a priori siti attivi noti (da controllare prima dello screening, vedi sopra), oppure questi siti di contatto spesso forniscono anche tasche e punti caldi in cui i frammenti possono legarsi. Tali colpi di frammento saranno artefatti del reticolo di cristallizzazione e probabilmente non si legheranno alla proteina in soluzione. Questi eventi tendono a verificarsi più spesso negli esperimenti di ammollo che negli esperimenti di co-cristallizzazione (probabilmente a causa delle maggiori concentrazioni di frammenti impiegate negli esperimenti di ammollo). Tuttavia, secondo l'esperienza precedente, generalmente costituiscono solo una piccola parte dei colpi ottenuti. Ad esempio, nella campagna di convalida F2X-Entry Screen utilizzando l'endotiapepsina (EP) e il complesso proteina-proteina spliceosomiale di Prp8RNaseH e Aar2 (AR), la maggior parte dei colpi si è verificata in sitipromettenti 11. Per il PE, 27 dei 37 eventi di legame osservati sono stati localizzati nel sito attivo (cioè la fenditura peptidica di questa proteasi). I 10 eventi di associazione remota comprendono due eventi di legame esposti a solvente e otto eventi di legame a contatto con il cristallo (corrispondenti a cinque colpi unici). L'esclusione di questi riscontri di contatto cristallini rifletterebbe comunque un tasso complessivo del 24% di successi unici per la campagna del PE. È anche importante notare che anche eventi di legame remoti di un sito attivo noto (ad eccezione dei leganti a contatto con i cristalli) potrebbero essere potenzialmente interessanti (ad esempio, rivelando nuovi punti caldi o siti allosterici della proteina). Per la campagna AR (nella stessa pubblicazione), dei 23 eventi di legame osservati, sette sono stati localizzati a contatto con i cristalli, uno è stato localizzato all'interfaccia diretta delle due proteine, sette sono stati localizzati in siti noti di interazioni proteina-proteina con altri partner leganti del contesto biologico più ampio (quindi diverse fasi di assemblaggio dello spliceosoma), otto eventi di legame hanno rivelato due punti caldi su AR di funzione ancora sconosciuta e uno si trova su una superficie esposta al solvente di Prp8RnaseH. Pertanto, escludendo gli eventi ai contatti di cristallo e il singleton Prp8RnaseH, il numero di eventi di binding potenzialmente utili è 15 (corrispondente a 14 hit uniche) quindi un tasso di successo del 15,6%. Questi colpi possono essere punti di partenza per la progettazione di modulatori di interazione proteina-proteina o per composti utensile volti ad esplorare i due punti caldi Aar2 scoperti. Nel complesso, anche in linea con le campagne degli utenti condotte, spesso solo una piccola parte dei colpi nello screening dei frammenti cristallografici deve essere ignorata come artefatti. Tuttavia, anche questo dipenderà in larga misura dall'obiettivo.

Se il tasso di hit è significativamente più basso, questo può indicare uno dei seguenti problemi relativi alla proteina bersaglio. Ad esempio, in una campagna CFS contro una proteasi virale della cisteina è stato osservato un tasso di successo di solo il 3% (dati non mostrati). Si è scoperto che la proteina utilizzata era probabilmente modificata chimicamente nel suo sito attivo. In tal caso, una diversa preparazione proteica può risolvere il problema. Se i cristalli sono molto intolleranti al DMSO, la schermata di ingresso F2X può essere utilizzata anche senza DMSO, anche se i risultati possono differire in una certa misura. Anche la maggior parte dei successi ottenuti in presenza di DMSO si presenterà in sua assenza. Ci saranno anche alcuni colpi che non possono essere osservati in assenza di DMSO, anche se possono essere osservati in sua presenza. E infine, ce ne saranno alcuni che si presenteranno solo in assenza di DMSO.

La difficoltà più grave si verifica se la proteina subisce un movimento indotta sul legame della sostanza. Molto probabilmente, il reticolo cristallino non tollererà il moto proteico e i cristalli si disintegreranno. In tal caso, l'unica scelta è ricorrere alla co-cristallizzazione della proteina e dei frammenti. Ciò può, tuttavia, portare a nuove forme cristalline. Pertanto, gran parte dell'automazione dell'intero processo non funzionerà più in modo efficiente. Fortunatamente, nella maggior parte delle campagne CFS condotte finora all'HZB, questo tipo di problema non è stato riscontrato. Può darsi che il debole legame di un frammento non fornisca abbastanza energia per indurre un moto proteico, in particolare se la conformazione cristallizzata è stabilizzata da forze di impacchettamento del cristallo.

Un'altra grave limitazione del metodo che gli autori hanno incontrato finora è quando il cocktail di cristallizzazione (e quindi la soluzione di ammollo) contiene composti volatili. Quindi diventa quasi impossibile eseguire tutta la manipolazione del cristallo in modo significativo.

Proteine diverse possono contenere siti drogabili in misura maggiore o minore. Ad esempio, le interazioni proteina-proteina sono solitamente mediate da superfici piane estese che sono più difficili da indirizzare. Il tasso di attacco del frammento dipenderà quindi probabilmente dalla struttura della superficie molecolare della proteina. In un caso estremo, una proteina potrebbe non contenere punti caldi superficiali adatti che fungono da siti bersaglio per il legame dei frammenti. Pertanto, nonostante un esperimento meticolosamente eseguito, nessun frammento colpi sarà risultato dallo screening. Tuttavia, gli autori non hanno finora riscontrato una situazione del genere.

In linea di principio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la parte di ammollo e raccolta dei cristalli di una campagna CFS può essere eseguita in qualsiasi laboratorio attrezzato per la movimentazione dei cristalli. Ciò distingue la metodologia a HZB dalle altre strutture CFS e può essere un vantaggio in alcuni casi. Ad esempio, se i cristalli non possono essere facilmente ri-prodotti in un altro sito o se il viaggio degli sperimentatori è limitato (ad esempio, in una situazione pandemica mondiale), gli utenti di HZB sono quindi dotati dell'intera attrezzatura (dischi, strumenti, telaio EasyAccess, portacampioni, ecc.) come set portatile.

Tuttavia, i requisiti per un gran numero di portacampioni e capacità di stoccaggio criogenico sono ancora più convenientemente soddisfatti in impianti CFS dedicati. Inoltre, la necessità di una raccolta di molti set di dati di diffrazione sostiene fortemente la localizzazione di queste strutture vicino alle linee di fascio che sono orientate verso un'elevata produttività del campione. Esempi per questo sono le linee di fascio I04-1 presso la Diamond Light Source e l'impianto XChem associato nelRegno Unito 8,25,le travi MASSIF presso l'ESRF in Francia26 o lo stabilimento FragMAX presso la linea di fascio BioMAX al MAX IV in Svezia18.

In futuro, si potrebbe immaginare di progettare esperimenti CFS senza la necessità di una manipolazione del cristallo del tutto. Sono stati segnalati i primi progressi in questa direzione. Ad esempio, mediante trasferimento acustico di liquidi che consente la miscelazione sia delle soluzioni contenenti cristalli che delle soluzioni di frammenti direttamente sui supporti campione di tipo mesh27. Un altro approccio è stato utilizzato per lo screening del ligando basato su XFEL. In un esperimento proof-of-principle, un liquame di cristallo è stato preparato in batch e la raccolta dei dati di ammollo e diffrazione è stata eseguita su un chip target fisso in silicio28. Tuttavia, questi approcci sono ancora in fase di sviluppo e lungi dall'essere applicabili a un'ampia gamma di obiettivi proteici o fattibili per gli impianti CFS come routine.

Con il protocollo in questo lavoro sono state delineate istruzioni dettagliate per eseguire con successo campagne CFS direttamente all'HZB (e altrove) e sono state fornite indicazioni generali e utili suggerimenti pratici nella preparazione e nello svolgimento di tali esperimenti con maggiori possibilità di successo. In definitiva, quote migliori e tassi di successo nello screening CFS contribuiscono in gran parte a fornire in modo efficiente punti di partenza per lo sviluppo a valle di composti di utensili o candidati ai farmaci.

Dichiarazioni

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Una domanda di brevetto relativa al telaio EasyAccess è stata depositata da Helmholtz-Zentrum Berlin presso l'Ufficio tedesco dei brevetti e dei marchi con il numero di registrazione DE 10 2018 111 478.8. Inoltre, è stata presentata una domanda di brevetto internazionale attraverso la rotta PCT, utilizzando la priorità del brevetto tedesco.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i numerosi gruppi di utenti che hanno eseguito campagne CFS all'HZB. Il loro feedback ha portato al miglioramento incrementale del nostro flusso di lavoro. Vogliamo ringraziare il gruppo di progettazione di farmaci dell'Università di Marburgo e il gruppo FragMAX di MAX IV, poiché le strette collaborazioni sono state la base per diversi salti di sviluppo per migliorare il CFS. Siamo grati per il supporto del Ministero federale tedesco dell'istruzione e della scienza (BMBF), attraverso i progetti Frag2Xtal e Frag4Lead (numeri 05K13M1 e 05K16M1). Siamo inoltre grati per il supporto tramite iNEXT-Discovery, numero di progetto 871037, finanziato dal programma Horizon 2020 della Commissione Europea.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 µ L pipettaEppendorfEP3123000012
pipetta a 12 canali, 100 & micro; LEppendorfEP4861000791
AsciugacapelliTH-Geyer9.106 788
Cristallo contenente piastreContiene cristalli da immergere Incubatore
cristallizzazioneFornisce una temperatura costante per l'esperimento di cristallizzazione, a HZB: 20° C
MicroLoops a doppio spessore (LD) di diverse dimensioni di aperturaMiTeGenvari, ad es.
M5-L18SP-75LD		250 loop nelle dimensioni appropriate necessarie per il protocollo, possono essere forniti da HZB 
EasyAccess FrameHZBL'EasyAccess Frame è un dispositivo speciale per la manipolazione di cristalli multipli, sviluppato presso l'HZB (Barthel et al., 2021).
Piastra dello schermo F2X-EntryHZBHa sviluppato lo schermo F2X-Entry (Wollenhaupt et al., 2020)
Piastra spot in vetroVWRMARI1406506
AzotoAlmeno una lattina da 5 L piena
Lattina di stoccaggio dell'azoto liquidon.a.n.a.Bacchetta
di cristallo MagenticMiTeGenM-R-1013198
MicroscopiLeican.a.MRC
3 lenti 96 pozzetti a basso profilo piastra di cristallizzazioneSwissCI3W96TLP-UVPPer cristalli imbevuti di finzione (opzionale)
Serbatoio reagenteCarl RothEKT6.125 ml di volume
Modello di tracciamentohttps://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.
xlsx
BisturiB. BraunBA825SU
Pellicola sigillante per piastre per microtitolazioneGreinerBioOne676070
Canne da spedizione per dischi riposti (per Unipuck)MiTeGenM-CP-111-0652 canne in alluminio; può essere fornito dalla
soluzione di ammollo HZB Sono necessari almeno 5 ml
soluzione di ammollo tra cui crioprotettore, 150µ Necessario solo se la soluzione di ammollo non è già crioprotettiva
Tessuti Roth (Kimberly Clark Professional)AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)MiTeGenTW-CX1002 dewar da viaggio per lo stoccaggio delle 2 canne unipuck, in alternativa potrebbe essere utilizzato un dewar di stoccaggio del tipo VHC35 o simile.
Dewar in schiuma Unipuck con coperchioMiTeGenM-CP-111-022due dewar in schiuma particolarmente adatti per la manipolazione di unipuck descritti nel protocollo
se si utilizzano dischi SPINE, potrebbe essere necessario applicare dewar in schiuma diversi.
Unipuck starter setMiTeGenM-CP-UPSK001Può essere fornito dall'HZB
UnipucksMiTeGenM-CP-111-02114 unipuck; può essere fornito dall'HZB
di cristallizzazione di liquido del campione di L

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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