Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte da suini (piPSC) in cellule progenitrici neurali (NPC)

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per la differenziazione chimica e la coltura di cellule progenitrici neurali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte da suini (piPSC).

Abstract

I neuroni derivati da iPSC sono modelli in vitro interessanti per studiare la neurogenesi e i cambiamenti fenotipici precoci nelle malattie mentali, soprattutto quando la maggior parte dei modelli animali utilizzati nella ricerca preclinica, come i roditori, non sono in grado di soddisfare i criteri per tradurre i risultati in clinica. I primati, i canini e i suini non umani sono considerati modelli più adeguati per la ricerca biomedica e lo sviluppo di farmaci, principalmente a causa delle loro somiglianze fisiologiche, genetiche e anatomiche con gli esseri umani. Il modello suino ha suscitato particolare interesse nelle neuroscienze traslazionali, consentendo test di sicurezza e allotrapianto. Qui viene descritta la generazione di iPSC suine insieme alla sua ulteriore differenziazione in cellule progenitrici neurali (NPC). Le cellule generate esprimevano i marcatori NPC Nestina e GFAP, confermati dalla RT-qPCR, ed erano positive per Nestina, b-Tubulina III e Vimentina mediante immunofluorescenza. Questi risultati mostrano l'evidenza della generazione di cellule NPC-like dopo induzione in vitro con inibitori chimici da un modello animale di grandi dimensioni, un modello interessante e adeguato per la ricerca in medicina rigenerativa e traslazionale.

Introduzione

Anche se molti ricercatori mirano a comprendere meglio i meccanismi cellulari e lo sviluppo patologico delle malattie neurologiche sull'uomo, ci sono molte limitazioni all'uso di tecniche non invasive sull'uomo come la risonanza magnetica (MRI) e l'impossibilità, nella maggior parte dei casi, di applicare tecniche invasive come il tracciamento del tratto e la registrazione intracellulare¹. È anche difficile ottenere tessuto cerebrale post-mortem di buona qualità poiché gli stati agonici prolungati dei donatori possono influenzare il cervello e interferire con gli studi². Pertanto, è necessario che i modelli animali, che sono stati utilizzati per diversi decenni nella ricerca traslazionale, siano sia rilevanti che discutibili fino ad oggi. La scelta di un particolare modello animale sta diventando una questione centrale nella recente progettazione e pianificazione sperimentale, chiarendo che per ottenere risultati coerenti, la selezione del modello più appropriato richiede una profonda conoscenza non solo della fisiologia delle diverse specie ma anche, soprattutto, degli obiettivi specifici della ricerca³.

Tuttavia, i modelli animali presentano spesso limitazioni quando capitolano la struttura e lo sviluppo del cervello umano poiché ha alcune caratteristiche di sviluppo, anatomiche, molecolari e genetiche uniche. Pertanto, è alquanto difficile interpretare ed estrapolare i dati raccolti dagli animali utilizzati nella ricerca, come i dati dei roditori¹.

Tra la grande varietà di modelli animali disponibili al giorno d'oggi, compresi i modelli transgenici, alcuni animali di grandi dimensioni sono considerati di grande valore, come i primati non umani, i canini e i suini⁴. Le somiglianze fisiologiche, genetiche e anatomiche tra l'uomo e il maiale per quanto riguarda le dimensioni degli organi sottolineano l'importanza di questi modelli nello sviluppo di approcci diagnostici e terapeutici. In particolare, il modello suino ha suscitato particolare interesse per le neuroscienze traslazionali, consentendo test di sicurezza e allotrapianto. È stato utilizzato nella ricerca relativa alle affezioni cardiovascolari, polmonari, gastrointestinali e, in particolare, per testare nuove terapie (ad esempio, in studi di medicina rigenerativa con cellule staminali^{5, 6}).

In questo contesto, i modelli in vitro, e più specificamente i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), sono modelli interessanti per consentire lo studio della neurogenesi e dei cambiamenti fenotipici precoci nelle malattie mentali, soprattutto quando la maggior parte dei modelli animali utilizzati nella ricerca preclinica, come i roditori, non sono in grado di soddisfare i criteri per tradurre i risultati in clinica.

L'uso delle iPSC ha notevolmente beneficiato le neuroscienze consentendo la modellazione della malattia in vitro, in particolare utilizzando cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da iPSC, poiché le NPC hanno dimostrato di essere uno strumento interessante per la modellazione della malattia in vitro ^7,8,9. Le iPSC sono state generate con successo da pazienti con malattia di Alzheimer¹⁰, schizofrenia¹¹ e molte altre malattie come il morbo di Parkinson, la sindrome di Rett, l'atrofia muscolare spinale, la sindrome di Down e la sclerosi laterale amiotrofica². Sono stati riportati anche sistemi modello animali preclinici che utilizzano NPC derivati da iPSC come innesti spinali funzionali con risposta immunitaria minima o assente^rilevata 12,13,14.

In questo articolo viene descritta la generazione di iPSC suine e l'ulteriore differenziazione chimica in cellule progenitrici neurali putative (Figura 1 e Figura 2). Le cellule generate esprimevano i marcatori NPC Nestina e GFAP, confermati dalla RT-qPCR, ed erano positive per Nestina, β-Tubulina III e Vimentina mediante immunofluorescenza. Questi risultati mostrano l'evidenza della generazione di cellule NPC-like dopo induzione in vitro con inibitori chimici da un modello animale di grandi dimensioni, un modello importante e adeguato per la ricerca in medicina rigenerativa e traslazionale.

Protocollo

Questi esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale della Facoltà di Scienze Animali e Ingegneria Alimentare dell'Università di San Paolo (numeri di permesso: n° 5130110517 e n°4134290716).

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono la coltura cellulare e l'incubazione vengono eseguite in atmosfera controllata (38,5 °C e 20% di CO₂ nell'aria, umidità massima). Il passaggio cellulare è stato eseguito mediante incubazione di 5 minuti con reagente di dissociazione e le cellule sono state recuperate dopo la centrifugazione (300 x g).

1. Riprogrammazione dei fibroblasti suini in iPSC

1. Preparazione dell'esperimento
   1. Preparare i fibroblasti e 293 terreni di coltura costituiti da Dulbecco's Medium modificato (IMDM) di Iscove integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,1 mM di aminoacidi non essenziali e l'1% di antibiotici (penicillina/streptomicina) se non diversamente specificato.
   2. Preparare il terreno di coltura iPSC (terreno di riprogrammazione) costituito da DMEM/F12 a bassa osmolalità (ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte) integrato con il 20% di sierosostituito, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di glutammina, 3,85 μM di β-mercaptoetanolo, 10 ng/mL di bFGF e l'1% di antibiotici.
   3. Quando necessario, seminare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) in un pallone T75 (10 ml) per ottenere una confluenza del 70-80% nel giorno successivo (circa 6 x 10⁵ per T75). Il giorno successivo, inattivare mediante un'incubazione di 2 ore e 30 minuti con 200 μL di 0,5 mg/mL di mitomicina C (aggiungere mitomicina nel T75 contenente MEF senza previa modifica del terreno).
   4. Dopo il periodo di incubazione, recuperare le cellule dopo l'incubazione con una soluzione di dissociazione per 5 minuti e seminare in pozzetti precedentemente rivestiti di gelatina in una piastra a 6 pozzetti a una concentrazione di 1x10⁵ .
   5. Rivestire i pozzetti incubandoli con una soluzione di gelatina allo 0,1% per 20 minuti a 37 °C (circa 1 mL di soluzione di gelatina per pozzetto per coprire l'intero pozzetto) e aspirare immediatamente. Quindi, rimuovere la soluzione e sostituirla con terreno di coltura (2 mL per pozzetto).
2. Trasfezione e produzione lentivirale
   1. Coltura di 293 cellule in fiasche di coltura T75 fino a raggiungere circa il 90% di confluenza.
   2. Dissociare le cellule e seminare 5 x 10⁶ cellule per ogni nuovo pallone T75 senza antibiotici.
   3. Il giorno successivo, preparare due soluzioni per pallone (T75) per la trasfezione: 1: 1,5 mL di IMDM (senza antibiotici, senza siero) con la concentrazione appropriata di ciascun vettore (12 μg di OSKM; 1,2 μg di TAT; 1,2 μg di REV; 1,2 μg di hgpm2 e 2,4 μg di VSVG_{di 2° generazione}); e 2: 1,5 ml di IMDM (senza antibiotici, senza siero) più 36 μl di reagente per lipofezione (o come raccomandato dal produttore) ¹⁵.
   4. Mescolare le soluzioni e incubare per 15 minuti.
   5. Nel frattempo, sostituire il terreno delle 293 cellule, aggiungendo solo 7 mL di IMDM integrati con il 10% di FBS per matraccia.
   6. Dopo il periodo di incubazione, aggiungere 3 ml di reagente per lipofezione + plasmidi in ogni fiaschetta. Sostituire il fluido con IMDM 10% FBS dopo 6 ore (opzionale).
   7. Raccogliere il terreno (volume completo - 10 ml per T75) ai punti temporali di 24, 48 e 72 ore. Filtrarlo con un filtro PVDF da 0,45 mm e pesarlo per il bilanciamento prima dell'ultracentrifugazione.
   8. Centrifugare per 1 ora e 30 minuti a 48.960 x g.
   9. Scartare il surnatante versando e incubare il contenuto rimanente (circa 200 μl) per 1 ora a 4 °C.
   10. Risospendere delicatamente il pellet virale, pipettandolo su e giù più volte e aliquotare la soluzione virale.
3. Trasduzione
   1. Seme 2x10⁴ fibroblasti per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Includere pozzetti per analisi molecolari (ad es. PCR) e controlli di trasduzione (ad es. analisi GFP) (opzionale).
   2. Il giorno seguente, rimuovere 1 mL di terreno e aggiungere 1 μL di bromuro di esadimetrina (8 μg/mL) e 50 μL di soluzione virale.
   3. Incubare per 3-4 ore, quindi effettuare un cambio completo del terreno (2 mL) (Giorno 0).
   4. Colture di cellule per 5 giorni, cambiando terreno ogni 2 giorni.
   5. Preparare preventivamente piastre gelatinose allo 0,1% e MEF come descritto al punto 1.1.3.
   6. Per dissociare le cellule e riplaccare le cellule nel terreno di riprogrammazione, lavare i pozzetti utilizzando 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovi PBS.
   7. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione per pozzetto e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
   8. Trasferire le cellule in una provetta conica e centrifugare le cellule per 5 minuti a 300 x g e risospenderle in 1-3 mL di terreno di coltura iPSC.
   9. Contare le cellule utilizzando una camera Neubauer o un'apparecchiatura contacellule e seminarle a una concentrazione di 1-2 x 10⁴ in pozzetti precedentemente rivestiti di gelatina allo 0,1% e coperti da MEF.
   10. Cambiare il terreno di coltura iPSC ogni 2 giorni.
   11. Le colonie di iPSC (al passaggio 0, P0) appariranno a circa 10 giorni dal periodo di riprogrammazione. Prelevare manualmente le colonie morfologicamente tipiche (bordi arrotondati e cellule con un alto rapporto nucleo-citoplasma) utilizzando un ago da 26 G per staccare la colonia e i MEF circostanti.
   12. Trasferire 1 colonia per ogni nuovo pozzetto, singolarmente, utilizzando un puntale per pipetta da 10 o 100 μl, per la coltura clonale e la caratterizzazione di linee cellulari iPSC putative.
4. IPSC suina passaging
   1. Passaggio manuale e raccolta delle colonie
      1. Pulire e trasferire un microscopio invertito in una cappa a flusso laminare.
      2. Sterilizzare il microscopio con luce ultravioletta (UV) per 15 minuti.
      3. Lavare i pozzetti precedentemente rivestiti di gelatina e MEF con PBS prima del trasferimento della colonia. Rimuovi PBS.
      4. Aggiungere 2 ml di terreno iPSC.
      5. Individua la colonia di interesse nel pozzo che verrà utilizzato.
      6. Usando lo smusso di un ago da siringa da insulina, separa la colonia dalle cellule circostanti.
      7. Se la colonia è piccola, staccarla dal pozzetto pipettando il terreno su e giù per i bordi con una pipetta da 10 μl.
      8. Se si tratta di una colonia più grande, tagliarla in alcuni segmenti più piccoli con l'ago.
      9. Aspirare la colonia o i frammenti della colonia con una pipetta da 10 μl.
      10. Trasferiscilo nel nuovo pozzo.
   2. Passaggio enzimatico di linee clonali
      1. Lavare i pozzetti utilizzando PBS. Rimuovi PBS.
      2. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione per pozzetto e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
      3. Trasferire circa 100 μl di cellule in un nuovo pozzetto. Questa quantità può variare tra le diverse linee cellulari; Pertanto, l'analisi visiva quotidiana della confluenza è altamente raccomandata.

2. Induzione di iPSC suine in NPC

1. Preparazione dell'esperimento
   1. Preparare il terreno di induzione neurale (NIM) composto per il 50% da terreno neurobasale e per il 50% da DMEM/F-12 integrato con vitamina A B27-Minus (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), 1 mM di glutammina (10 μL/mL), penicillina-streptomicina (1 μL/mL). Filtrare la soluzione in un filtro da 0,22 μm e aggiungere l'inibitore della segnalazione BMP LDN193189 e l'inibitore di ALK SB431542 a una concentrazione finale rispettivamente di 0,1 μM e 10 μM.
   2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione di matrice e incubare a 37 °C per almeno 30 minuti. Rimuovere la soluzione della matrice e aggiungere il terreno E8 per la coltura delle iPSC.
   3. Il giorno 13 del protocollo di induzione, preparare il Neural Expansion Medium (NEM) composto per il 50% da terreno neurobasale e per il 50% da DMEM/F-12 integrato con vitamina A B27-Minus (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/mL), 1 mM di glutammina (10 μL/mL), penicillina-streptomicina (1 μL/mL). Filtrare la soluzione in un filtro da 0,22 μm e aggiungere FGF2 ed EGF per ottenere una concentrazione finale di 10 ng/mL.
2. Protocollo di induzione
   1. Il giorno prima che le iPSC raggiungano il 100% di confluenza, trasferire le cellule in un nuovo pozzetto (divisione 1:1). Lavare il pozzetto aggiungendo 1 ml di PBS. Rimuovi PBS.
   2. Aggiungere 1 mL di EDTA 0,5 mM e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
   3. Rimuovere l'EDTA e aggiungere 1 mL di terreno di coltura E8.
   4. Lavare delicatamente le celle dal pozzetto e trasferire il contenuto in un nuovo pozzetto precedentemente rivestito con una soluzione di matrice.
   5. Il giorno seguente, lavare i pozzetti con PBS. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 ml di NIM.
   6. Cambiare il mezzo di induzione ogni giorno per 14 giorni.
   7. Il giorno 14, lavare i pozzetti con PBS. Rimuovi PBS.
   8. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare per pozzetto e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
   9. Trasferire le cellule in una provetta conica e centrifugare le celle per 5 minuti a 300 x g e risospenderle in 6 mL di terreno NEM.
   10. Aggiungere 60 μL (10 μL/mL) di una soluzione di recupero post-scongelamento e trasferire 2 mL della soluzione in ciascun pozzetto rivestito con matrice.
   11. Cambiare il mezzo NEM il giorno successivo e poi ogni due giorni.
       NOTA: Si ritiene che ogni pozzo che ha attraversato il protocollo di induzione dia origine a una nuova linea NPC. Pertanto, le rispettive cellule non devono essere mescolate.

3. Passaggio NPC

1. Lavare bene con 1 ml di PBS. Rimuovi PBS.
2. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti.
3. Lavare delicatamente le cellule del pozzetto e trasferire il contenuto in un tubo conico.
4. Centrifugare la soluzione per 5 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante e aggiungere 6 mL di NEM.
5. Omogeneizzare delicatamente il pellet e trasferire 2 mL della soluzione in un nuovo pozzetto precedentemente rivestito con la soluzione della matrice.

Risultati

Caratterizzazione di piPSC
La caratterizzazione mirava a determinare l'acquisizione della pluripotenza delle cellule riprogrammate. A tale scopo, sono stati eseguiti la formazione di embrioidi, la colorazione in immunofluorescenza per marcatori di pluripotenza, l'espressione genica e la differenziazione spontanea in corpi embrioidi (EB).

Le colonie cellulari generate presentavano una morfologia piatta e compatta in cluster cellulari con bordi ben definiti, come previsto per...

Discussione

Attraverso questo protocollo, i fibroblasti sono stati riprogrammati in vitro utilizzando l'espressione esogena di OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4. Le cellule riprogrammate sono state mantenute in vitro per più di 20 passaggi. Quando questi lignaggi sono stati sottoposti alla differenziazione neuronale utilizzando inibitori chimici, hanno espresso i marcatori delle cellule progenitrici neuronali Nestina e GFAP, confermati dalla RT-qPCR, ed erano positivi per ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
293FT	Invitrogen	# R70007
piastre a 6 pozzetti	Costar	# 3516
anti-B-Tubulina III	abcam	# ab7751
anti-NANOG	abcam	# ab77095
anti-NESTIN	Millipore	# ABD69
anti-OCT4	Santa Cruz biotecnologia	# SC8628
anti-SOX2	abcam	# ab97959
anti-SSEA1	Millipore	# MAB4301
anti-TRA1-60	Millipore	# MAB4360
anti-VIMENTINA	abcam	# ab8069
B27-Minus Vitamina A	Life Technologies	# 12587010
DMEM/F-12	Life Technologies	# 11960
asino anti-capra 488	Invitrogen	#  A11055
EGF	Sigma	# E9644
Siero fetale bovino	Gibco	# 10099
FGF2	Peprotech	# 100-18B
GlutaMAX	Gibco	# 35050-061
Glutammina	Gibco	# 25030-081
capra anti-topo 594	Invitrogen	#  A21044
capra anti-coniglio 488	Invitrogen	# A11008
Bromuro di esadimetririna	Sigma Aldrich	# 107689
HighCapacity  kit	Life Technologies	# 4368814
IMDM	Gibco	# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	# 12660-012
Siero knockout sostituzione	Gibco	# 10828-028
LDN-193189	Sigma-Aldrich	# SML0559
Kit di fosfatasi alcalina leucocitaria	Sigma Aldrich	# 86R
Lipofectamine P3000 & commercio;	Invitrogen	# L3000-015
Matrigel	Corning	# 354277
Mitomicina C	Sigma Aldrich	# M4287-2MG
N2	Life Technologies	# 17502048
Nanodrop ND-1000	Nanodrop Technologies, Inc.
Medium neurobasale	Life Technologies	# 21103049
Aminoacidi non essenziali	Gibco	# 11140-050
Penicillina-Streptomicina	Gibco	# 15140-122
Revita Cell	Gibco	# A2644501
Rnase out	Life Technologies	# 10777019
SB431542	Stemgent	# 72232
StemPro Accutase	Gibco	# A11105-01
SW28 rotore	Beckman Coulter	# 342207
Trizol	Life Technologies	# 15596026
TrypLE Express	Gibco	# 12604-021
β-mercaptoethanol	Gibco	# 21985-023