Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.
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Articolo metodologico
Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I vettori di farmaci a base lipidica sono stati utilizzati per i sistemi di somministrazione clinicamente e commercialmente disponibili grazie alle loro piccole dimensioni, alla biocompatibilità e all'elevata efficienza di incapsulamento. L'uso di nanoparticelle lipidiche (LNP) per incapsulare gli acidi nucleici è vantaggioso per proteggere l'RNA o il DNA dalla degradazione, promuovendo al contempo l'assorbimento cellulare. Gli LNP contengono spesso più componenti lipidici tra cui un lipide ionizzabile, lipide helper, colesterolo e lipide coniugato polietilenglicole (PEG). Gli LNP possono facilmente incapsulare gli acidi nucleici a causa della presenza lipidica ionizzabile, che a basso pH è cationica e consente la complessazione con RNA o DNA caricati negativamente. Qui gli LNP sono formati incapsulando l'RNA messaggero (mRNA) o il DNA plasmidico (pDNA) utilizzando una rapida miscelazione dei componenti lipidici in una fase organica e della componente dell'acido nucleico in una fase acquosa. Questa miscelazione viene eseguita utilizzando una precisa piattaforma di miscelazione microfluidica, che consente l'autoassemblaggio delle nanoparticelle mantenendo il flusso laminare. Le dimensioni idrodinamiche e la polidispersità sono misurate utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS). La carica superficiale effettiva sull'LNP è determinata misurando il potenziale zeta. L'efficienza di incapsulamento è caratterizzata utilizzando un colorante fluorescente per quantificare l'acido nucleico intrappolato. Risultati rappresentativi dimostrano la riproducibilità di questo metodo e l'influenza che i diversi parametri di formulazione e di processo hanno sui LNP sviluppati.
Introduzione
I vettori farmaceutici sono utilizzati per proteggere e fornire una terapia con proprietà favorevoli tipiche tra cui bassa citotossicità, aumento della biodisponibilità e miglioramento della stabilità1,2,3. Nanoparticelle polimeriche, micelle e particelle a base lipidica sono state precedentemente esplorate per l'incapsulamento e il rilascio di acidi nucleici4,5,6,7. I lipidi sono stati utilizzati in diversi tipi di sistemi nanocarrier, compresi i l....
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Protocollo
Uno schema del processo complessivo è fornito nella Figura 1.
1. Preparazione dei buffer
NOTA: il filtraggio sterile dei tamponi è altamente consigliato qui per rimuovere eventuali particelle che possono influire sulla qualità dell'acido nucleico e dell'LNP.
- Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)
- Preparare 1x PBS utilizzando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl in acqua priva di nucleasi e regolare il pH a 7,4.
- Sterilizzare mediante filtrazione sotto vuoto utilizzando un filtro a pori da 0,2....
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Risultati
Più lotti di LNP con la stessa formulazione lipidica e rapporto N/P di 6 sono stati sviluppati in giorni separati per dimostrare la riproducibilità della tecnica. I lotti 1 e 2 hanno determinato distribuzioni dimensionali sovrapposte con polidispersità simile (Figura 2A) Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle dimensioni o nell'efficienza di incapsulamento tra i due diversi lotti (Figura 2B). L'efficienza di i.......
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Discussione
Riproducibilità, velocità e screening a basso volume sono vantaggi significativi dell'utilizzo della miscelazione microfluidica per formare LNP rispetto ad altri metodi esistenti (ad esempio, idratazione del film lipidico e iniezione di etanolo). Abbiamo dimostrato la riproducibilità di questo metodo senza alcun impatto sull'efficienza di incapsulamento o sulla dimensione delle particelle osservate con diversi lotti LNP. Questo è un criterio essenziale affinché qualsiasi terapia, compresi gli LNP, diventi clinicamente di.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti di Sanofi. Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse o interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Grazie ad Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas per la loro guida e il loro contributo allo sviluppo di LNP.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metossipolietilenglicole-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µ l Punte con filtro graduato (senza RNasi-,DNasi-, DNA) | Stati Uniti d'America Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µ l Puntali con filtro graduato (senza RNasi, DNasi, DNA) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 &; l Punte filtranti smussate (senza RNasi, DNasi, DNA) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 &; l Puntali filtranti graudati (senza RNasi-,DNasi-, DNA) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-idrossi-5-colestene, 5-colesten-3β-olo (colesterolo) | Siringhe sterili Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip (siringa da 1 ml) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Siringhe sterili con punta scorrevole (siringa da 3 ml) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer Aghi per siringhe per uso generico (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Centrifuga da banco | Coltro | ||
| Piastre nere a 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT Provette per microcentrifuga prive di RNasi, DNasi, DNA (1,5 ml) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Acido citrico | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Filtro sottovuoto/Sistema di bottiglie di conservazione, 0,22 pori Corning | 430769 | ||
| Celle capillari ripiegate monouso | Malvern | DTS1070 | |
| Alcool etilico, Puro 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro | Cuvette Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Provette coniche (15 mL) (senza DNasi-RNasi) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeUnità filtranti ultracentrifughe Sigma | Amicon Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Precisione da banco | Nanyosystems | ||
| Acqua priva di nucleasi | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen Kit per il dosaggio del dsDNA | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Kit di analisi dell'RNA Quant-iT RiboGreen | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Citrato di sodio, diidrato, granulare | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
Riferimenti
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.
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Ristampe e permessi
