Questo protocollo fornisce una guida dettagliata per l'allotrapianto generazionale iniziale e continuo di tumori della Drosophila nell'addome di ospiti adulti per lo studio di vari aspetti della neoplasia. Utilizzando un apparato autoiniettore, i ricercatori possono ottenere una migliore efficienza e resa tumorale rispetto a quelli ottenuti con metodi manuali tradizionali.
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Articolo metodologico
Allotrapianto tumorale in Drosophila melanogaster con iniettore auto-nanolitro programmabile
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive l'allotrapianto di tumori in Drosophila melanogaster utilizzando un apparato di iniezione auto-nanolitro. Con l'uso di un apparato autoiniettore, gli operatori addestrati possono ottenere risultati di trapianto più efficienti e coerenti rispetto a quelli ottenuti utilizzando un iniettore manuale. Qui, copriamo gli argomenti in modo cronologico: dall'incrocio delle linee di Drosophila , all'induzione e dissezione del tumore primario, al trapianto del tumore primario in un nuovo ospite adulto e al trapianto generazionale continuato del tumore per studi estesi. Come dimostrazione, qui usiamo i tumori ad anello immaginale indotti dalla sovraespressione della ghiandola salivare indotti dal dominio intracellulare di Notch (NICD) per il trapianto generazionale. Questi tumori possono prima essere indotti in modo affidabile in un microambiente della zona di transizione all'interno degli anelli immaginali della ghiandola salivare larvale, quindi allografati e coltivati in vivo per studiare la continua crescita, l'evoluzione e le metastasi del tumore. Questo metodo di allotrapianto può essere utile in potenziali programmi di screening farmacologico, nonché per lo studio delle interazioni tumore-ospite.
Introduzione
Questo protocollo fornisce una guida passo-passo per l'allotrapianto di tumori dell'anello immaginale della ghiandola salivare larvale (SG) di Drosophila negli addominali di ospiti adulti utilizzando un apparato di iniezione di auto-nanoliti (ad esempio, Nanoject). Questo protocollo fornisce anche indicazioni per la successiva ri-allocuzione dei tumori in nuove generazioni di ospiti adulti, che offre opportunità per uno studio longitudinale continuo delle caratteristiche del tumore, come l'evoluzione del tumore e le interazioni tumore-ospite. Il protocollo può anche essere applicato a esperimenti di screening dei farmaci.
Questo me....
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Protocollo
1. Preparazione del tumore dell'anello immaginale SG
- Incrocia le mosche adulte con genotipi di UAS-NICD (maschio: 10-15 mosche) e Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (femmina vergine: 10-15 mosche) e permetti loro di riprodursi per 1 giorno a 18 °C. Le mosche adulte selezionate dovrebbero avere 5-9 giorni per garantire un'elevata fertilità.
- Lasciare che le mosche adulte depongano le uova nel cibo per mosche contenuto in flaconcini per 24 ore a 18 °C, quindi rimuovere le mosche adulte.
NOTA: il cibo volante viene preparato utilizzando la ricetta standard di farina di mais del Drosophila Stock Center
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Risultati
Qui, abbiamo effettuato l'allotrapianto generazionale di tumori dell'anello immaginale SG utilizzando l'apparato autoiniettore di iniezione di nanoliti e condotto il successivo imaging dal vivo del tumore con un microscopio a scansione laser confocale, che ha permesso un'immersione più approfondita in argomenti di crescita tumorale, migrazione delle cellule tumorali e interazioni tumore-ospite. Quando si montano le mosche, incollarle a un vetrino per microscopio e trattenerle tramite un blocco11 d.......
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Discussione
L'allotrapianto tumorale può aiutare i ricercatori ad affrontare alcuni problemi che sorgono durante la crescita e la progressione del tumore Drosophila. Una di queste sfide è l'elusione delle morti premature di larve o adulti portatori di tumore durante la coltura tumorale primaria12. In questo contesto, l'allotrapianto tumorale continuo consente ai tumori di crescere indefinitamente, il che facilita gli studi longitudinali sulla crescita, le metastasi e l'evoluzione del tumore. L'allotr.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare tra gli autori.
Ringraziamenti
Ringraziamo gli ex membri del laboratorio Dr. Sheng-An Yang e Mr. Juan-Martin Portilla per il loro contributo nello sviluppo di questo protocollo. Siamo grati al laboratorio del Dr. Yan Song presso la Scuola di Scienze della Vita dell'Università di Pechino per aver condiviso il loro protocollo sull'allotrapianto manuale. Ringraziamo anche il signor Calder Ellsworth e il signor Everest Shapiro per la lettura critica del manoscritto.
WMD ha ricevuto finanziamenti (GM072562, CA224381, CA227789) per questo lavoro dal National Institute of Health (https://www.nih.gov/) e finanziamenti (IOS-155790) dalla National Science Foundation (htps://nsf.go....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | LSM 980 | Conosciuto anche come "Zeiss LSM 980" |
| Farina di mais Cibo per mosche | Bloomington Drosophila Stock Center | N/A | Conosciuto anche come "BDSC Standard Cornmeal Food" |
| Ago di dissezione (30Gx1/2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| Piastra di dissezione | Fisher | Scientific 12-565B | |
| Fly Tape | Fisherbrand | 159015A | |
| Adattatore di fluorescenza per microscopio Stero | Microscopia elettronica Scienze | SFA-UV | Conosciuto anche come "Adattatore per fluorescenza NightSea" |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | 495015-0001-000 | Conosciuto anche come "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| Pinze | Strumenti per la scienza fine | 11251-10 | Conosciuto anche come "Dumont #5 Forceps" |
| Capillare in vetro (3,5 '') | Colla Drummond | 3-000-203-G / X | |
| Elmer | E305 | Conosciuto anche come "Elmer Washabale Clear Glue" | |
| Microscopio ottico | Zeiss | 435063-9010-100 | Conosciuto anche come "Zeiss Stemi 305" |
| Estrattore per micropipette | World Precision Instruments | PUL-1000 | Conosciuto anche come "Estrattore per micropipette a quattro fasi"" |
| Apparecchio Nanoject Drummond | 3-000-204 | Conosciuto anche come "Iniettore automatico Nanoject II" | |
| Siringa | Medium ThermoFisher | 21720001 | |
| (27G x1/2) | BD Fiala | 305109 | |
| Fisherbrand | AS507 |
Riferimenti
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
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Ristampe e permessi
