Descriviamo un protocollo per monitorare i cambiamenti nell'attività dei neuroni afferenti durante i comandi motori in un modello di sistema di cellule ciere vertebrate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
I sistemi sensoriali raccolgono segnali essenziali per dirigere il comportamento, ma gli animali devono decifrare quali informazioni sono biologicamente rilevanti. La locomozione genera segnali di disafferente che gli animali devono districare dai segnali sensoriali rilevanti dell'ambiente circostante. Ad esempio, quando un pesce nuota, il flusso generato dalle ondulazioni del corpo viene rilevato dai neurositi meccanorecettivi, che comprendono cellule ciliate, che compongono il sistema di linee laterale. Le cellule ciliate trasmettono quindi informazioni sul movimento del fluido dal sensore al cervello attraverso i neuroni afferenti sensoriali. Contemporaneamente, la scarica corollare del comando motorio viene trasmessa alle cellule ciliate per evitare sovraccarichi sensoriali. La contabilizzazione dell'effetto inibitorio dei segnali motori predittivi durante la locomozione è, quindi, fondamentale quando si valuta la sensibilità del sistema di linee laterale. Abbiamo sviluppato un approccio elettrofisiologico in vivo per monitorare contemporaneamente l'attività del neurone afverso della linea laterale posteriore e della radice motoria ventrale nelle larve di zebrafish (4-7 giorni dopo la fecondazione) che può durare diverse ore. Le registrazioni extracellulari dei neuroni afferenti si ottengono utilizzando la tecnica del patch clamp sciolto, che può rilevare l'attività da singoli o più neuroni. Le registrazioni delle radici ventrali vengono eseguite attraverso la pelle con elettrodi di vetro per rilevare l'attività dei motoneuroni. Il nostro protocollo sperimentale offre il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni o evocati nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e comportamentale.
Introduzione
Neuroni afferenti di sistemi meccanosensoriali trasmettono informazioni dalle cellule ciliate al cervello durante l'udito e l'equilibrio. L'elettrofisiologia può rivelare la sensibilità dei neuroni afferenti attraverso registrazioni dirette. Mentre l'applicazione di patch a cellule intere dalle cellule ciliate può essere impegnativa, la registrazione da neuroni a valle è più semplice e consente la valutazione dei potenziali d'azione in risposta allestimolazioni controllate 1,2,3. Stimolare le cellule ciliate porta alla loro deflessione, che modifica le strutture meccanicosens....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le cure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida.
1. Preparazione di materiali per registrazioni elettrofisiopatiche
- Crea una teglia di registrazione con fondo in elastomero in silicone.
- Erogare un sottile strato di componenti elastomeri siliconi auto-miscelati (ad esempio, Sylgard) in un piatto di coltura tissutale con fondo di vetro di copertura fino a quando non si sovrapponi al bordo di pozzo poco profondo. Circa 0,5 mL sono sufficienti.
- Coprire e curare il piat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Dopo che le larve di zebrafish sono state correttamente immobilizzate e la linea laterale posteriore si ottiene ganglio afferente e registrazione VR, l'attività sia nei motoneuroni che nei motoneuroni può essere misurata contemporaneamente. I canali di registrazione vengono visualizzati utilizzando protocolli di registrazione gap-free (passaggio 1.4) per il monitoraggio continuo dell'attività afferente e VR. In tempo reale, si possono osservare diminuzioni del tasso di picco afferente spontaneo simultaneo all'attività VR.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo sperimentale descritto fornisce il potenziale per monitorare i cambiamenti endogeni nell'input sensoriale attraverso i comportamenti motori in un vertebrato intatto e si comporta. In particolare, descrive in dettaglio un approccio in vivo all'esecuzione simultanea di registrazioni extracellulari di neuroni afferenti a linea laterale e radici motorie ventrali nel pesce zebra larvale. L'attività spontanea efferente è stata precedentemente caratterizzata nel pesce zebra senza considerare la potenziale attività.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine il sostegno del National Institute of Health (DC010809), della National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) e del Whitney Laboratory for Marine Biosciences di J.C.L. Ringraziamo i membri passati e presenti del Liao Lab per aver stimolato le discussioni.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Becher da 100 mL | PYREX | 1000 | per mordenzante |
| Obiettivo ad immersione in acqua 10x | Olympus | UMPLFLN10xW | a basso ingrandimento per il posizionamento delle larve e l'elettrodo di registrazione |
| Obiettivo ad immersione in acqua 40x | Olympus | LUMPLFLN40XW | ingrandimento maggiore per la posizione della punta dell'elettrodo e la definizione del patch-clamp |
| abfload.m | script | MATLAB scritto su misura per la conversione di registrazioni elettrofisiologiche grezze in file .mat | |
| codifica supplementare | AffVR_preprocess.m | script MATLAB scritto su misura per la pre-elaborazione dei dati di registrazione | |
| Cavi coassiali BNC | ThorLabs | 2249-C-12 | che collega i canali dell'amplificatore e del digitalizzatore; richiede 4 |
| capillari in vetro borosilicato con filamento | Warner Strumenti | G150F-3 | diametro interno: 0,86, diametro esterno: 1,50; vetro capillare utilizzato per formare elettrodi di registrazione |
| burst_detect | file di codifica supplementare | funzione MATLAB scritta personalizzata necessaria per eseguire AffVR_preprocess.m | |
| computer N/A | N/A | qualsiasi computer dovrebbe funzionare | |
| Alimentatore CC | Tenma | 72-420 | utilizzato per l'incisione elettrica dei perni di dissezione |
| digitalizzatore per elettrofisiologia | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | consente l'acquisizione del filamento di dati patch-clamp |
| Sutter Instrument Company | FB255B | Filamento a scatola da 2,5 mm utilizzato nell'estrattore per micropipette | |
| pinze fini | Fine Science Tools | Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Articolo n. 11295-10 | utilizzato per manipolare le larve e inserire perni |
| DIC a stadio fisso microscopio | Microscopio Olympus | BX51WI | utilizzato per visualizzare e stabilire registrazioni di patch clamp |
| punta per pipetta flessibile e affusolata | Fisher Scientific | 02-707-169 | consentono l'inserimento nell'elettrodo di registrazione per erogare la soluzione extracellulare sulla punta |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | coperchio piatto di registrazione con fondo in vetro |
| KimWipe KimTech | 34155 | salvietta da lavoro utilizzata per eliminare il liquido in eccesso dalle larve | |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | elastomero sylgard automiscelante |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | per la pre-elaborazione dei dati |
| Amplificatore per microelettrodi | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplificatore per registrazioni a doppio canale |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | per lucidare il micromanipolatore dell'elettrodo di registrazione |
| unità di controllo | Siskiyou | MC1000-eR/T | Coordinatore a quadrante a 4 assi per il controllo del micromanipolatore |
| estrattore di micropipette | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | per l'estrazione del vetro capillare negli elettrodi di registrazione |
| unità di controllo del microscopio | Siskiyou | MC1000e | posiziona il microscopio attorno al tavolino fisso e alla preparazione |
| micromanipolatore | motorizzatoSiskiyou | MX7600 | posiziona l'headstage e l'elettrodo di registrazione collegato per la registrazione patch-clamp |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | scaricabile da Axon MultiClamp 700B Commander pagina di download |
| tavolo ottico ad aria | Newport Corporation | VH3036W-OPT | tavolo di isolamento breadboard per il microscopio galleggiante e ridurre al minimo le vibrazioni durante le registrazioni |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | scaricabile da Axon pCLAMP 10 Acquisizione dati di elettrofisiologia e Software di analisi Scarica la pagina |
| Marcatore a inchiostro permanente | Sharpie | ordina da amazon.com | per marcare il lato anteriore dell'elettrodo VR per garantire il corretto orientamento durante l'inserimento nel portapipetta |
| Capsula di Petri | Falcon | 35-3001 | utilizzato per immergere le larve nel |
| portapipetta | Molecular Devices | 1-HL-U tiene | l'elettrodo di registrazione e lo collega all'headstage |
| trasduttore pneumatico | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | per il controllo della pressione interna dell'elettrodo di registrazione |
| idrossido di potassio | Sigma-Aldrich | 221473-25G | mordenzante per mordenzatura perni di dissezione |
| tubi in silicone | Tygon | 14-169-1A | per collegare il trasduttore pneumatico al portapipetta |
| spike_detect | file | di codifica supplementarefunzione MATLAB scritta su misura necessaria per eseguire AffVR_preprocess | |
| stereomicroscopio | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | utilizzato per visualizzare le punte dei perni e durante la preparazione delle larve |
| lama di rasoio a lama dritta | Canopus | ordine da amazon.com | taglia il filo di tungsteno mentre esegue i perni di dissezione |
| swimbout_detect | file | di codifica supplementarefunzione MATLAB scritta personalizzata necessaria per eseguire la siringa AffVR_preprocess.m | |
| Becton Dickinson Compoany | 309602 | riempita con soluzione extracellulare per iniettare negli elettrodi di registrazione pipetta | |
| trasferimento | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | pipetta monouso, non sterile per il trasferimento di larve |
| tricaina metansolfonato | Syndel | 12854 | Anestetico farmaceutico utilizzato per l'eutanasia delle larve ad alto dosaggio. |
| filo di tungsteno | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 pollici, 50.8 μ m di diametro; utilizzato per realizzare perni di dissezione unità di |
| filtrazione sottovuoto | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | unità di filtrazione monouso, sterili, sottovuoto utilizzate per sterilizzare la soluzione extracellulare utilizzata per elettrofisiologia elettrodo ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | fornito con amplificatore MultiClamp 700B utilizzato come headstage sinistro e destro |
| α-bungarotossina | ThermoFisher | B1601 | per immobilizzare le larve prima della registrazione |
Riferimenti
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
