Method Article

Analisi multiplexata dell'espressione genica retinica e dell'accessibilità alla cromatina utilizzando scRNA-Seq e scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, gli autori mostrano l'utilità di MULTI-seq per la fenotipizzazione e il successivo accoppiato scRNA-seq e scATAC-seq nel caratterizzare i profili di accessibilità trascrittomica e cromatina nella retina.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potenti tecniche di sequenziamento di nuova generazione offrono un'analisi robusta e completa per studiare come funzionano le reti di regolazione genica retinica durante lo sviluppo e negli stati patologici. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ci consente di profilare in modo completo i cambiamenti di espressione genica osservati nello sviluppo retinico e nella malattia a livello cellulare, mentre l'ATAC-Seq a cellula singola consente di profilare l'analisi dell'accessibilità della cromatina e del legame del fattore di trascrizione a risoluzione simile. Qui viene descritto l'uso di queste tecniche nella retina in via di sviluppo e viene dimostrato MULTI-Seq, in cui i singoli campioni sono etichettati con un complesso oligonucleotide-lipidico modificato, consentendo ai ricercatori di aumentare la portata dei singoli esperimenti e ridurre sostanzialmente i costi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Capire come i geni possono influenzare il destino cellulare gioca un ruolo chiave nell'interrogare processi come la malattia e la progressione embrionale. Le complesse relazioni tra i fattori di trascrizione e i loro geni bersaglio possono essere raggruppate in reti di regolazione genica. Prove crescenti collocano queste reti di regolazione genica al centro sia della malattia che dello sviluppo attraverso i lignaggi evolutivi1. Mentre tecniche precedenti come la qRT-PCR si concentravano su un singolo gene o insieme di geni, l'applicazione della tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento consente la profilazione di trascrittomi cellulari co....

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Protocol

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L'uso di animali per questi studi è stato condotto utilizzando protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee, in conformità con le linee guida ARRIVE, e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative pertinenti.

1. MULTI-seq

  1. Preparazione dei media
    1. Preparare ed equilibrare l'inibitore dell'ovomucoide, 10 mg di inibitore dell'ovomucoide e 10 mg di albumina per mL di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), per 30 minuti prima dell'uso13. Equilibrare con 95% O2:5% CO2 in un incubatore.
      1. Preparare la soluzione ....

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Results

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Questo flusso di lavoro delinea una strategia per lo studio dei fenotipi dello sviluppo e dei processi regolatori utilizzando il sequenziamento a singola cellula. Il multiplexing di campioni MULTI-seq consente un test di fenotipizzazione iniziale a basso costo, mentre la raccolta e la fissazione accoppiate di campioni per scRNA-seq e scATAC-seq consentono un'indagine più approfondita (Figura 1).

Il codice a barre MULTI-seq consente il sequenziamento combinato di p.......

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Discussion

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La potenza di MULTI-seq deriva dalla perfetta integrazione dei dati provenienti da più condizioni o modelli sperimentali e dall'enorme vantaggio in termini di costi e limitazione degli effetti batch. L'utilizzo di MULTI-seq offre una profondità di fenotipizzazione senza precedenti in laboratorio. I metodi di multiplexing non genetici come l'hashing cellulare o l'hashing dei nuclei hanno aperto la porta a campioni multiplexati attraverso l'uso di anticorpi con codice a barre

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Disclosures

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Niente da rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo Linda Orzolek della Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core per l'aiuto nel sequenziamento delle librerie prodotte e Lizhi Jiang per aver eseguito gli espianti retinici ex vivo .

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 µ L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L puntali
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100 &; M Richiesta di soluzione per codici a barredal laboratorio Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= vero
100% etanoloMillipore SigmaE7023-500ML
100% metanoloMillipore Sigma322415-100ML
10x Chip Holder 10xGenomica1000195
10x controller di cromo & Kit di accessori10x GenomicsPN-120263
15mL Tubo da centrifugaQualità biologicaP886-229411
40 &; m FlowMi Filtro CellulareBel-ArtH13680-0040
50 µ M Anchor SolutionSigma o richiesta dal laboratorio Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= vero
50 µ M Co-Anchor SolutionSigma o richiesta dal laboratorio Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= vero
5200 Sistema di analisi dei frammentiAgilentM5310AA
70 um FlowMi filtro cellulareBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R CentrifugaVWRBK392302
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9647
Cromo Successivo GEM Chip G10x GenomicaPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Kit di reagenti ATAC a cellula singola Chromium Next Gem v1.110x GenomicsPN-1000175
Cromo a cellula singola 3' GEM, libreria e Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Microscopio da dissezioneLeica
DNA LoBind Tubes, 1,5 mLEppendorf22431021
Dry Ice EVA
Foam Ice PanTequipment04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water BathFisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed IncubatorThermoFisher Scientific3110
Glicerolo 50% Soluzione acquosaRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Camera di conteggio Bright-LineFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq o NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Bassa qualità del tampone TEBiologico351-324-721
Soluzione di cloruro di magnesio 1 MSigma-AldrichM1028
Separatore magnetico per provette da 1,5 mLMillipore Sigma20-400
Separatore magnetico per 200 & micro; Provette L10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma o IDTVedere l'elenco delle
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Acqua priva di nucleasiFisher ScientificAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 micropipetteEppendorf
Sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
Centrifuga refrigerata 5424 REppendorf2231000655
Pestelliper pellet monouso senza RNasiFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus Inibitore della RNasiPromegaN2615
RPI primerSigma o IDTVedere l'elenco delle
Kit indice singolo N, Set A10x GenomicsPN-1000212
Kit indice singolo T Set A10x GenomicsPN-1000213
Soluzione di cloruro di sodio 5 MSigma-Aldrich59222C
Kit di reagenti SPRIselectBeckman CoulterB23318
Pipette di trasferimento monouso standardFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR Striscia a 8 provetteUSA Scientific1402-4700
Soluzione di tricloruro di Trizma, pH 7,4Soluzione di tripano Sigma-AldrichT2194
0,4% (p/v)Corning25-900-CI
Primer universale I5Sigma o IDTVedere l'elenco delle
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
per pipettesequenzesequenze, sequenze

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (....

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Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

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