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Articolo metodologico

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule fetali della sindrome di Turner (45XO) per la modellazione a valle dei deficit neurologici associati alla sindrome

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DOI:

10.3791/62240

4 dicembre 2021

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la generazione di iPSC libere da integrazione da fibroblasti del tessuto fetale attraverso la somministrazione di plasmidi episomiali mediante nucleofezione seguita dalla descrizione dei metodi utilizzati per la caratterizzazione iPSC e la differenziazione neuronale.

Abstract

Le aneuploidie cromosomiche causano gravi malformazioni congenite tra cui malformazioni del sistema nervoso centrale e morte fetale. Lo screening genetico prenatale è puramente diagnostico e non chiarisce il meccanismo della malattia. Sebbene le cellule dei feti aneuploidi siano preziose materie biologiche che portano l'aneuploidia cromosomica, queste cellule sono di breve durata, limitandone l'uso per esperimenti di ricerca a valle. La generazione di modelli di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) è un metodo efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua dei tratti aneuploidi. Si auto-rinnovano e si differenziano in cellule specializzate che ricordano lo sviluppo embrionale. Pertanto, le iPSC servono come strumenti eccellenti per studiare i primi eventi di sviluppo. La sindrome di Turner (TS) è una condizione rara associata a un cromosoma X completamente o parzialmente mancante. La sindrome è caratterizzata da infertilità, bassa statura, disturbi endocrini, metabolici, autoimmuni e cardiovascolari e difetti neurocognitivi. Il seguente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di fibroblasti dal tessuto fetale TS (45XO), la generazione di TSiPSC libere da integrazione attraverso la somministrazione di plasmidi di riprogrammazione episomiale mediante nucleofezione seguita da caratterizzazione. Le TSiPSC di riprogrammazione sono state inizialmente sottoposte a screening mediante colorazione di fosfatasi alcalina a cellule vive, seguita da un'ampia indagine per i biomarcatori di pluripotenza. Colonie selezionate sono state sezionate meccanicamente, sono state attraversate più volte e cellule stabili auto-rinnovanti sono state utilizzate per ulteriori esperimenti. Le cellule hanno espresso fattori di trascrizione a pluripotenza OCT4, NANOG, SOX2, marcatori di superficie cellulare SSEA 4 e TRA1-81 tipici delle cellule staminali pluripotenti. Il cariotipo 45XO originale è stato mantenuto dopo la riprogrammazione. Le TSiPSC sono state in grado di formare corpi embrioidi e differenziarsi in cellule di endoderma, mesoderma ed ectoderma esprimendo biomarcatori specifici del lignaggio ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). I plasmidi episomiali esogeni sono stati persi spontaneamente e non rilevati dopo il passaggio 15 nelle cellule. Queste TSiPSC sono una preziosa risorsa cellulare per modellare il neurosviluppo molecolare e cellulare difettoso che causa deficit neurocognitivi associati alla sindrome di Turner.

Introduzione

Le aneuploidie portano a difetti alla nascita / malformazioni congenite e perdita di gravidanza negli esseri umani. ~ 50% -70% dei campioni da perdite di gravidanza mostrano anomalie citogenetiche. Gli embrioni aneuploidi persi all'inizio della gravidanza non possono essere facilmente ottenuti per l'analisi sperimentale, sollevando la necessità di sviluppare altri modelli che rappresentino da vicino l'embriogenesi umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule con diagnosi di disturbi genetici sono state utilizzate per modellare le irregolarità genetiche rappresentative e le loro conseguenze sullo sviluppo fetale1,<....

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Protocollo

FCV sono stati ottenuti dal Manipal Hospital, Bengaluru, sotto l'approvazione del Comitato Etico degli Ospedali Manipal.

NOTA: vedere la Tabella 1 per la composizione di tutti i buffer e le soluzioni.

1. Isolamento dei fibroblasti dai villi corionici fetali (FCV)

  1. Raccolta del campione e disintegrazione dei tessuti nella collagenasi
    1. Raccogliere FCV in condizioni sterili in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e trasportare (a temperatura ambiente) all'impianto di coltura cellulare.
    2. Trasferire i villi in una capsula di Petri ....

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Risultati

Generazione di iPSC senza integrazione da un feto abortito spontaneamente con cariotipo 45XO
Abbiamo isolato fibroblasti da FCV con un cariotipo 45XO specifico per la sindrome di Turner (TS) e li abbiamo nucleoatizzati con plasmidi di riprogrammazione episomiale per generare TSiPSC che possono essere utilizzate per la modellazione a valle della sindrome, in particolare i deficit neurologici associati (Figura 1a&b). Abbiamo usato vettori episomiali non.......

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Discussione

La generazione di modelli cellulari stabili di tessuto fetale citogeneticamente anormale è necessaria per perpetuare il fenotipo difettoso. La via iPSC è il metodo più efficace di preparazione cellulare per la conservazione perpetua delle proprietà difettose20.

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) mostrano proprietà di auto-rinnovamento e differenziazione in cellule specializzate che ricordano gli embrioni di scissione precoce21. Quindi, i PSC.......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il sostegno finanziario per la ricerca di cui sopra è stato fornito da Manipal Academy of Higher Education. La caratterizzazione della linea è stata condotta parzialmente nel laboratorio di M.M. Panicker presso NCBS. Ringraziamo Anand Diagnostic Laboratory per l'assistenza con il cariotipo.

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,15% tripsinaThermo Fisher Scientific27250018G Banding
2-mercaptoetanoloThermo Fisher Scientific21985023Pluripotenza e terreno corporeo embrioide
4', 6 diamidino-2-fenilindoloSigma AldrichD8417Immunocitochimica
Activina ASigma AldrichSRP3003Saggi
di differenziazioneFosfatasi alcalina Live StainThermo Fisher ScientificA14353Colorazione AP
AMAXA Nucleofector II
AmnioMAX II terreno completoThermo Fisher Scientific, Gibco11269016Medium specifico per colture cellulari di villi coriali fetali
AmpicillinaHiMediaTC021Purificazione plasmidi
Anti IgG di topo (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11059Immunocitochimica
Anti IgG di coniglio (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA11034Immunocitochimica
Anti IgG di coniglio (H+L) Alexa Fluor 546InvitrogenA11035Immunocitochimica
Antibiotico-AntimicoticoThermo Fisher Scientific, Gibco15240096Controllo
della contaminazioneAnti-E-CaderinaBD Biosciences610181Immunocitochimica
Anti-NanogBD Biosciences560109Immunocitochimica
Anti-OCT3/4BD Biosciences611202Immunocitochimica
Anti-SOX17BD Biosciences561590Immunocitochimica
Anti-SOX2BD Biosciences561469Immunocitochimica
Anti-SSEA4BD Biosciences560073Immunocitochimica
Anti-TRA 1-81MilliporeMAB4381Immunocitochimica
Fattore di crescita dei fibroblasti basici [FGF2]Sigma AldrichF0291Pluripotenza media
Fattore morfogenetico osseo 4Sigma AldrichSRP3016 Saggi di differenziazione
Bovino Albumina siericaSigma AldrichA3059Collagene bloccante
Umano di tipo IVBD Biosciences 354245Saggi di differenziazione
Miscela di collagenasiSigma AldrichC8051Digestione dei villi coriali fetali
DesametasoneSigma AldrichD4902Saggi di differenziazione
DMEM F12Thermo Fisher Scientific11320033Saggi di differenziazione
FastDigest EcoR1Thermo ScientificFD0274Digestione di restrizione
FibronectinaSigma AldrichF2518Saggi di differenziazione
Giemsa StainHiMediaS011G Banding
Acido acetico glacialeHiMediaAS001Fissativo per cariotipo
GlucosioSigma AldrichG7528Saggi di differenziazione
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Pluripotenza e terreno corporeo embrioide
Eparina sodicaSigma AldrichH3149Saggi di differenziazione
Soluzione di insulina umanaSigma AldrichI9278Saggi di differenziazione
Insulina Transferrina SeleniteSigma AldrichI1884Saggi di differenziazione
Kit KAPA HiFi PCRKapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX ColcemidThermo Fisher Scientific 15210040Arresto mitotico per cariotipo
KnockOut DMEMThermo Fisher Scientific10829018Pluripotenza e corpo embrioide medio
KnockOut Siero sostitutivoThermo Fisher Scientific10828028Pluripotenza e terreno corporeo embrioide
Luria Bertani agarHiMediaM1151FPurificazione plasmidica
MatrigelBD Biosciences356234Saggi di differenziazione
MEM Aminoacidi non essenzialiThermo Fisher Scientific11140035Pluripotenza e terreno corporeo embrioide
MetanoloHiMediaMB113Fissativo per cariotipo
Miosina catena pesante ventricolare &alfa;/βMilliporeMAB1552Immunocitochimica
NHDF Kit NucleofectorLonzaVAPD-1001Nucleofection
Paraformaldeide (PFA)Sigma AldrichP6148Cellule di fissaggio
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-FAddgene27077Plasmide di riprogrammazione episomiale
pCXLE-hSKAddgene27078Plasmide di riprogrammazione episomiale
pCXLE-hULAddgene27080Riprogrammazione episomiale Plasmide
Penicillina Streptomicina  Thermo Fisher Scientific,  15070063Pluripotenza e corpo embrioide medio
Falloidina- Tetrametilrodamina B isotiocianatoSigma AldrichP1951Immunocitochimica
Soluzione salina tamponata con fosfatoSigma AldrichP44171 X PBS 1 compressa di PBS disciolta in 200 ml di acqua deionizzata e sterilizzata in autoclave
Conservazione: Temperatura ambiente.
PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS.
Conservazione: Temperatura ambiente.
Kit di purificazione dei plasmidi - Midi prepQIAGEN12143Purificazione dei plasmidi
Soluzione di cloruro di potassioHiMediaMB043Soluzione ipotonica per cariotipizzazione
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104Isolamento genomico del DNA
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093Terreno di differenziazione degli epatociti
Citrato di sodioHiMediaRM255Soluzione ipotonica per cariotipo
Triton X-100HiMediaMB031Permeabilizzazione
Tripsina-EDTA (0,05%)Thermo Fisher Scientific, Gibco25300054Sottocoltura di   fibroblasti dei villi coriali fetali
Tween 20HiMediaMB067Preparazione di PBST
β III tubulinaSigma AldrichT8578Immunocitochimica
Y-27632 dicloridratoSigma AldrichY0503Saggi di differenziazione
Lonza-Nucleofection

Riferimenti

  1. Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
  2. Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome ....

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Ristampe e permessi

Tag

Aneuploidia cromosomicagenerazione di iPSCriprogrammazione episomialeisolamento dei fibroblastimarcatori di pluripotenzaformazione di corpi embrioididifferenziamento dei foglietti embrionalideficit neurocognitivi