Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra due molecole di fluorofori può essere utilizzato per studiare le interazioni proteiche nella cellula vivente. Qui, viene fornito un protocollo su come misurare la FRET nelle cellule vive rilevando l'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice utilizzando la microscopia a scansione laser confocale.
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Articolo metodologico
Valutazione delle interazioni proteiche nelle cellule vive con emissione sensibilizzata alla FRET
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è il trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza e dall'orientamento delle molecole, nonché dall'entità della sovrapposizione tra gli spettri di emissione del donatore e di assorbimento dell'accettore. FRET permette di studiare l'interazione delle proteine nella cellula vivente nel tempo e in diversi compartimenti subcellulari. In letteratura sono stati descritti diversi algoritmi basati sull'intensità per misurare la FRET utilizzando la microscopia. Qui vengono forniti un protocollo e un algoritmo per quantificare l'efficienza FRET sulla base della misurazione sia dell'emissione sensibilizzata dell'accettore che della tempra della molecola donatrice. La quantificazione della FRET raziometrica nella cellula vivente richiede non solo la determinazione della diafonia (spill-over spettrale, o bleed-through) delle proteine fluorescenti, ma anche l'efficienza di rilevazione della configurazione microscopica. Il protocollo fornito qui descrive come valutare questi parametri critici.
Introduzione
L'analisi basata sulla microscopia del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) consente di valutare le interazioni tra proteine in cellule vive. Fornisce informazioni spaziali e temporali, comprese informazioni su dove nella cellula e in quale compartimento subcellulare avviene l'interazione e se questa interazione cambia nel tempo.
Theodor Förster pose le basi teoriche della FRET nel 19481. La FRET è un trasferimento di energia senza radiazioni da un donatore eccitato a una molecola accettore e dipende dalla distanza delle molecole e dall'orientamento relativo dei loro dipoli di transizione, nonché d....
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Protocollo
1. Costruzione plasmidica
- Per generare la sonda di fusione eGFP-mCherry1, utilizzare un vettore di espressione cellulare di mammifero N1 (vedi Tabella dei materiali) con mCherry110 inserito utilizzando i siti di restrizione AgeI e BsrGI.
- Utilizzare i seguenti oligonucleotidi per amplificare eGFP11 senza codone di stop come frammento di SalI-BamHI : N-terminale primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' e C-terminale primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
- Inserire questo frammento SalI-BamHI nel sito di....
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Risultati
La Figura 1 mostra le immagini ottenute rispettivamente nel canale donatore, canale 1 (488, 505-530 nm), canale di trasferimento, canale 2 (488, >585 nm) e canale accettore, canale 3 (561, >585 nm). Immagini rappresentative di cellule che esprimono solo GFP, solo Cherry, che co-esprimono GFP e Cherry ed esprimono la proteina di fusione GFP-Cherry. Le efficienze medie di FRET cellulare calcolate nelle cellule NRK che esprimono la proteina di fusione GFP-.......
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Discussione
Il protocollo presentato descrive in dettaglio l'uso della sonda di calibrazione della proteina fluorescente uno-a-uno geneticamente accoppiata per quantificare la FRET utilizzando la rilevazione dell'emissione sensibilizzata dell'accettore e la tempra della molecola donatrice mediante microscopia confocale. Questo metodo può essere applicato per valutare le interazioni proteiche nel contesto fisiologico della cellula vivente in diversi compartimenti subcellulari. La risoluzione spaziale può essere ulteriormente migliora.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Neuroscience Imaging Service della Stanford University School of Medicine per aver fornito attrezzature e spazio per questo progetto. Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento intramurale dello Stanford Cancer Institute e della Gynecologic Oncology Division Stanford, nonché da GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 dal National Research, Development and Innovation Office, Ungheria.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5% Tripsina-EDTA senza rosso fenolo (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Camere LabTek a 8 pozzetti #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutammina (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
Riferimenti
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
