Rilevamento dell'accumulo di amiloide-β mediante colorazione immunofluorescente in un modello murino di Alzheimer

Sommario

Nella neuropatologia della malattia di Alzheimer, una delle caratteristiche più cruciali è la deposizione di amiloide-β. In questo protocollo, descriviamo il metodo di colorazione immunofluorescente in topi transgenici 5×FAD per rilevare l'accumulo di amiloide-β nelle placche. Verrà descritto in dettaglio il processo di perfusione, criosezione, colorazione e quantificazione.

Abstract

La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa che contribuisce al 60-70% delle demenze in tutto il mondo. Uno dei tratti distintivi dell'AD risiede senza dubbio nell'accumulo di amiloide-β (Aβ) nel cervello. L'Aβ è prodotto dalla scissione proteolitica della proteina precursore della beta-amiloide (APP) da parte della β-secretasi e della γ-secretasi. In circostanze patologiche, l'aumento della scissione β dell'APP porta alla sovrapproduzione di Aβ, che si aggrega nelle placche di Aβ. Poiché le placche di Aβ sono una caratteristica della patologia dell'AD, rilevare la quantità di Aβ è molto importante nella ricerca sull'AD. In questo protocollo, introduciamo il metodo di colorazione immunofluorescente per visualizzare la deposizione di Aβ. Il modello murino utilizzato nei nostri esperimenti è il 5×FAD, che porta cinque mutazioni trovate nell'AD familiare umano. I deficit neuropatologici e comportamentali dei topi 5xFAD sono ben documentati, il che lo rende un buon modello animale per studiare la patologia Aβ. Introdurremo la procedura che include la perfusione transcardica, la criosezione, la colorazione immunofluorescente e la quantificazione per rilevare l'accumulo di Aβ nei topi 5×FAD. Con questo protocollo, i ricercatori possono studiare la patologia Aβ in un modello murino di AD.

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (AD) è una malattia neurodegenerativa che causa il 60%-70% della demenza in tutto il mondo e costa molte risorse sociali¹. È noto che l'accumulo di amiloide-β (Aβ) è un segno patologico della malattia di Alzheimer. La proteina precursore dell'amiloide (APP) è una proteina integrale di membrana che esiste in molti tessuti. Il peptide Aβ, costituito da 36-42 amminoacidi², è prodotto dalla successiva scissione della β- e della γ-secretasi in APP ^3,4. I cambiamenti nella scissione dell'APP e le mutazioni nel gen....

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Xuzhou Medical University e in conformità con le linee guida dei regolamenti governativi cinesi per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Perfusione di topi

NOTA: Maggiori dettagli sulla procedura di perfusione possono fare riferimento al video del laboratorio ¹¹ di Wiliam Shain.

1. Anestetizzare topi transgenici 5×FAD (C57BL/6J) con pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg di peso corporeo) mediante ini....

Risultati

Abbiamo utilizzato le procedure di colorazione immunofluorescente sopra descritte per studiare la deposizione di accumulo di Aβ in topi 5×FAD di età diversa. La Figura 3 rappresenta i risultati tipici e i risultati non ottimali utilizzando il nostro protocollo. Fette di cervello di topi transgenici eterozigoti 5×FAD di 5 e 8 mesi e di controllo wild-type da 4 a 6 mesi sono state colorate con anticorpi 6E10 e rilevate al microscopio a fluorescenza. La Figura 3A m.......

Discussione

La colorazione immunofluorescente con anticorpi 6E10 può rilevare in modo specifico l'accumulo di Aβ nel cervello, che è facile da quantificare con l'immagine J. Ciò che vale la pena notare è che alcuni passaggi cruciali di questo protocollo possono influenzare i risultati.

Per evitare che le fette si stacchino o si rompano mostrate nella Figura 3C, è necessario notare alcuni punti chiave. La perfusione dovrebbe procedere rapidame.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anesthetia
Siringa per iniezione	KLMEDICAL		1 mL
Pentobarbitual sodium	Sigma-Aldrich	P3761	1% in soluzione fisiologica per iniezione i.p.
Toracotomia:
IRIS-Fine Forbici per iride diritte (~11,5 cm)	RWD	S12010-11
Forbici chirurgiche curve affilate (11,5 cm)	RWD	S14016-11
Pinza da dissezione diritta (~10,5 cm)	RWD	F12010-10
Perfusione
Tubo centrifugo (5 mL)	Biosharp
Siringa per iniezione	KLMEDICAL		20 mL
Paraformaldeide	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M (PH7.2-7.4) polvere	Vicmed	VC2001P	Aggiungere acqua deionizzata per rendere la soluzione
Fissazione, disidratazione e criosezione
Adesione vetrini per microscopio	CITOTEST	188105	76,2 mm e 25,4 mm
Microtomo Criostato	LEICA	CM1950
Composto per temperatura di taglio ottimale (OCT)	Sakura Finetek	4583
Saccarosio	VETEC	V900116
Colorazione in immunofluorescenza
Microscopio a fluorescenza	OLYMPUS	IX-81
Anticorpo secondario anti-topo IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cibernetica		Software scientifico per la grafica e l'analisi dei dati
Scatola umida immunoistochimica (nera)	Sinylab	Personalizzato	300 mm & volte; 100 mm & volte; 38 mm, profondità della scanalatura 27 mm, può contenere 10 vetrini standard
Pipet	Thermo Scientific
Puntali	per pipette
Scatola di colorazione in plastica	Sinylab	personalizzata	30 mL, può contenere 5 vetrini standard
Tampone di diluizione dell'anticorpo primario	prodotto nel nostro laboratorio		1% BSA 1g, 0,3% Triton X-100 300ul, 0,01% sodio azide 10mg in 100ml PBS
Purificato anti beta amiloide, 1-16 anticorpo (6E10)	Biolegend	SIG-39320	500X
Soluzione rapida di recupero dell'antigene per congelato Sezioni	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
Quantification
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		Software di mappatura medica
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		Software scientifico di grafica e analisi dei dati