Microgoccioline sgusciate di dimetildiottadecilammonio a cambiamento di fase come promettente sistema di somministrazione di farmaci: risultati su sferoidi 3D di cellule tumorali di mammifero

Sommario

Le microgoccioline di decafluoropentano sviluppate con un guscio di dimetildiottodilammonio bromuro hanno mostrato un'eccezionale stabilità colloidale e una biointerfaccia attiva. I DDAB-MD si sono dimostrati efficienti serbatoi di farmaci caratterizzati da un'elevata affinità per le membrane plasmatiche insieme a un aumento dell'assorbimento e dell'attività antitumorale della doxorubicina contro il carcinoma mammario triplo negativo umano (MDA-MB-231) modello 3D.

Abstract

Il miglioramento significativo delle microgoccioline di perfluorocarburi (MD) a cambiamento di fase nel vasto scenario teranostico passa attraverso l'ottimizzazione della composizione delle MD per quanto riguarda l'efficienza di sintesi, la stabilità e la capacità di somministrazione dei farmaci. A questo scopo, sono stati progettati MD di decafluoropentano (DFP) stabilizzati da un guscio di tensioattivo cationico a bromuro di dimetildiottodilammonio (DDAB). Un'alta concentrazione di DDAB-MDs è stata prontamente ottenuta in pochi secondi mediante insonazione pulsata ad alta potenza, risultando in goccioline di dimensioni 1 μm a bassa polidispersione. Il potenziale ζ altamente positivo, insieme a lunghe catene di idrocarburi saturi del guscio DDAB, sono fattori chiave per stabilizzare la gocciolina e il carico di farmaci in essa contenuto. L'elevata affinità del guscio DDAB con la membrana plasmatica cellulare consente la somministrazione localizzata di chemioterapici aumentando la concentrazione del farmaco all'interfaccia cellulare tumorale e aumentando l'assorbimento. Ciò trasformerebbe i DDAB-MD in uno strumento di somministrazione di farmaci rilevante che mostra un'elevata attività antitumorale a dosi di farmaco molto basse.

In questo lavoro, l'efficacia di un tale approccio ha dimostrato di migliorare notevolmente l'effetto della doxorubicina contro gli sferoidi 3D delle cellule tumorali dei mammiferi, MDA-MB-231. L'uso di colture cellulari tridimensionali (3D) sviluppate sotto forma di sferoidi tumorali multicellulari (cioè cellule densamente impacchettate in una forma sferica) presenta numerosi vantaggi rispetto alle colture cellulari 2D: oltre ad avere il potenziale per colmare il divario tra gli studi in vitro convenzionali e i test sugli animali, migliorerà la capacità di eseguire in vitro più predittive saggi di screening per lo sviluppo preclinico di farmaci o valutare il potenziale di farmaci off-label e nuove strategie di co-targeting.

Introduzione

I vettori di somministrazione di farmaci in grado di garantire un'elevata efficacia antitumorale e di ridurre gli effetti collaterali sono obiettivi primari pur rimanendo una grave sfida chimico-farmaceutica ^1,2. Ad oggi, i loro progressi sono limitati in un primo momento dal contrasto tra un insufficiente rilascio di farmaci in situ e un livello critico di tossicità aspecifica ^3,4,5. Negli ultimi anni, sono stati implementati diversi sistemi di somministrazione di farmaci per migliorare la somministrazione di agenti antitumorali, tra cui liposomi, micelle polimeriche, polimerisomi 6,7,8,9,10. Questi sistemi mostrano il potenziale nell'aumentare il tempo di circolazione e la selettività dei farmaci, riducendo al contempo la distribuzione e l'accumulo in organi e tessuti sani. In ogni caso, le formulazioni incapsulate di farmaci chemioterapici antineoplastici, come le antracicline, hanno portato a una significativa riduzione dell'efficienza di internalizzazione dei farmaci. Recentemente, i trasportatori micron e submicron responsivi agli stimoli come le microbolle¹¹, le microgoccioline, le nanoparticelle d'oro ibride¹², i nano-idrogel¹³, gli scaffold PLGA e le piattaforme mesoporose¹⁴, hanno guadagnato interesse farmacologico per la loro elevata versatilità nel mirare ed esercitare effetti inibitori tumorali utilizzando doxorubicina (Dox) e docetaxel. Esperimenti pionieristici per trasformare questi portatori in efficienti soldati antitumorali per compiti multimodali (ad esempio, approcci chemioterapici, fototermici e sinergici genici) e imaging molecolare¹⁵ hanno aperto la strada alla nanomedicina teranostica personalizzata.

In questo scenario, le microgoccioline di perfluorocarburi a cambiamento di fase (MD) sono state valutate attraverso l'opportunità chiave che offrono di coniugare l'elevato carico di farmaci, la versatilità chimica del guscio MDs che affronta le barriere biologiche, la stabilità colloidale e l'efficienza di sintesi^11,12. Come ulteriore vantaggio, l'ecogenicità delle MD promossa dalla vaporizzazione acustica o ottica del nucleo del perfluorocarburo (PFC) consente di ottenere imaging in situ e una promettente efficacia terapeutica. Inoltre, la vaporizzazione del nucleo di MDs ottenuta dal rilascio di energia di fasci di particelle ionizzanti può essere sfruttata per l'inseguimento del fascio e la dosimetria della radiazione.

Il presente studio ha lo scopo di sviluppare microgoccioline di decafluoropentano (DFP) stabilizzate da un guscio utilizzabile multiplo di tensioattivo cationico a base di bromuro di dimetildiottodilammonio (DDAB). I DDAB shelled-MD soddisfano le aspettative sia fisico-chimiche che biologiche. È stato dimostrato che le microgoccioline a base di DFP sono preziosi agenti di contrasto a cambiamento di fase per ottenere MDs¹⁶ di perfluorocarburi biocompatibili e stabili. Il gel cristallino DDAB satura le catene lunghe a temperatura fisiologica, penetrando in profondità nel nucleo idrofobo, stabilizzando la gocciolina e il carico di farmaco in esso contenuto. Inoltre, l'elevato potenziale ζ positivo all'interfaccia dell'acqua migliora la stabilità colloidale dei MD. L'attrattiva biologica della superficie del guscio di DDAB risiede nella capacità di causare la morte di batteri e funghi, a concentrazioni che colpiscono a malapena le cellule dei mammiferi, e di legare membrane plasmatiche, proteine antigeniche caricate negativamente, nucleotidi, DNA o nanoparticelle. Le caratteristiche sopra menzionate possono essere sfruttate per generare una notevole azione immunoadiuvante, di terapia genica e antitumorale all'interno di cellule di mammifero¹⁷.

I DDAB-MD caricati con dox (Dox@DDAB-MD) qui descritti promuovono il rilascio del farmaco contro cellule di carcinoma mammario triplo negativo altamente aggressive, invasive e scarsamente differenziate. Di seguito viene descritto un protocollo semplice e rapido basato sull'insonazione di sonde ad alta potenza per ottenere DDAB-MD stabili e ad alta densità con una distribuzione dimensionale ristretta con un'elevata efficienza di carico di Dox in una formulazione in un solo passaggio. Tali caratteristiche sono competitive anche per altri metodi di preparazione come i dispositivi microfluidici e gli omogeneizzatori ad alto taglio¹⁶.

L'altro grande problema limitante nella progettazione di vettori efficienti per la somministrazione di farmaci è che l'attività di un farmaco è una funzione di vari parametri (ad esempio, assorbimento, distribuzione, concentrazioni) ottenibili in un vero bersaglio biologico, che non possono essere considerati da modelli cellulari monostrato¹⁸. Per questo motivo, la storia dello sviluppo di nuove formulazioni antitumorali è costellata di studi in vitro che purtroppo si sono rivelati inefficaci già a livello di modelli preclinici negli animali¹⁹.

In particolare, la necessità di passare dalle colture cellulari a un sistema più complesso e affidabile rispetto agli studi in vivo ed ex vivo è legata ai limiti intrinseci degli studi farmacologici sulle colture 2D. In questo contesto, sono inclusi i sistemi 3D in vitro, come sferoidi, organoidi, organ-on-chip, che simulano la morfologia, l'attività e la risposta fisiologica di strutture più complesse rispetto ai monostrati^{2D 20}. In una visione preclinica, i modelli cellulari 3D che imitano il microambiente cellulare offrono la possibilità di comprendere meglio la biologia complessa in un contesto fisiologicamente più pertinente in cui le colture monostrato tradizionali non sono efficaci^21,22.

Dopo aver dimostrato che i DDAB-MD possono interagire con la membrana cellulare delle cellule di carcinoma mammario umano, favorendo l'internalizzazione dei farmaci e la morte cellulare a concentrazioni di Dox molto basse (nanomolari), è stata testata l'efficacia di tale metodologia contro gli sferoidi 3D delle cellule tumorali dei mammiferi, MDA-MB-231.

Protocollo

NOTA: Tutti i reagenti e gli strumenti sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Fabbricazione e caratterizzazione di microgoccioline

1. Preparazione di DDAB-MD caricati con Dox
   1. Sciogliere la polvere di DDAB in etanolo per ottenere una concentrazione finale di 10 mM e un volume finale di 1 mL. Preparare 1 mL di soluzione madre Dox sciogliendo 2 mg di polvere di Dox in etanolo.
      ATTENZIONE: Dox è noto per avere tossicità orale acuta, categoria 4 e cancerogenicità, categoria 1B. Utilizzare solo sotto una cappa aspirante con guanti e una maschera sanitaria.
   2. Aggiungere 250 μl di DFP a 300 μl di soluzione DDAB (fase oleosa) in una provetta da centrifuga graduata in plastica da 15 mL.
      NOTA: La purezza di DFP è del 60% (GC), la densità è di 1,6 g/mL (20 °C), il punto di ebollizione è di 55 °C. La purezza Dox è 98,0-102,0% (HPLC). La purezza del DDAB è del ≥98% (TLC). La purezza dell'etanolo è del 97%.
   3. Aggiungere delicatamente 2,15 ml di acqua deionizzata sulla fase oleosa ottenendo una miscela acqua/olio bifase. Iniettare delicatamente 10 μL di soluzione di Dox direttamente nella fase oleosa immediatamente prima dell'insonazione per evitare la suddivisione di una quantità significativa di Dox nella fase acquosa.
   4. Emulsionare la miscela bifasica mediante insonazione della sonda (con una micropunta conica in titanio da 1/8 di pollice) utilizzando un'apparecchiatura di elaborazione di liquidi a ultrasuoni ad alta intensità in modalità a impulsi (0,7 s On e 0,3 s Off) a 20 kHz, 100 W per 10 s. Diluire immediatamente i MD appena preparati con acqua ultrafiltrata e deionizzata (ad es. MilliQ) di un fattore di 1,8.
      NOTA: Il fattore di diluizione è indicativo, scelto empiricamente. La soluzione di MDs può essere diluita di più, purché si ottenga una quantità sufficiente di pellet dalle centrifughe successive.
   5. Prelevare 1 mL della sospensione ottenuta e centrifugare 3 volte, risolundo in acqua ultrafiltrata e deionizzata (ad es. MilliQ) per rimuovere l'eccesso di Dox ed etanolo. Effettuare la prima centrifugazione a 25 °C, 360 x g per 3 min, e la seconda e la terza a 280 x g alla stessa temperatura e ora.
   6. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere l'acqua surnatante e prelevare 5 μL di pellet e disperderli in 2 mL di terreno per il trattamento cellulare, ottenendo una concentrazione di Dox equivalente di 10 nM.Le fasi del protocollo per la sintesi di Dox@DDAB-MD sono mostrate nella Figura 1.
      NOTA: La concentrazione di Dox equivalente è definita come la quantità di Dox libera contenuta nello stesso volume di una sospensione di Dox@DDAB-MD.
2. Caratterizzazione di DDAB-MD caricati con Dox
   1. Misurare la distribuzione dimensionale utilizzando un fotometro DLS (Dynamic Light Scattering) e analizzare i correlogrammi ottenuti con l'algoritmo CONTIN per estrapolare i tempi di decadimento associati. Quindi utilizzare i tempi di decadimento per determinare la distribuzione dei coefficienti di diffusione delle particelle (D) e, convertirli in una distribuzione di diametri idrodinamici (2R_H) utilizzando la relazione di Stokes-Einstein R_H = k_BT/6πηD, dove k_BT è l'energia termica del sistema e η la viscosità del solvente.
   2. Controllare le dimensioni e la distribuzione dimensionale anche utilizzando la microscopia a campo chiaro con un software di analisi delle immagini (es. Image J), misurando la dimensione di almeno 100 goccioline per fotogramma (per 3 o 4 fotogrammi), ottenendo un valore medio e una deviazione standard.
      NOTA: Per le misure DLS, diluire la soluzione MDs in acqua ultrafiltrata e deionizzata (ad es. MilliQ), PBS e in terreno di coltura cellulare per evitare la retrodiffusione a una concentrazione fissa di 1,5 x 10⁸ MDs/mL. Per l'acqua ultrafiltrata, deionizzata e PBS in terreno di coltura cellulare, abbiamo ottenuto valori di dimensione media rispettivamente di 1,1 ± 0,1 μm, 1,1 ± 0,25 μm e 1,2 ± 0,2 μm. I MD recuperati dai pellet, dopo la centrifugazione, non mostrano alcuna variazione dimensionale all'interno degli errori.
   3. Utilizzare un vetrino della camera di conteggio delle cellule per la microscopia per valutare la concentrazione di MD. La camera è composta da due diverse aree di conteggio con uno spessore di 0,10 mm. Posizionare 10 μl di sospensione MDs sulla camera. Conta i MD all'interno del quadrato 0,25 x 0,25 nm² della camera utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a lunga distanza 40x e analizza con un freeware per l'analisi delle immagini.
   4. Calcolare la concentrazione di MDs, espressa come numero di MDs/mL, secondo l'equazione:
      
   5. Controllare il Dox internalizzato mediante immagini al microscopio laser a scansione confocale (CLSM) sfruttando l'autofluorescenza Dox a 590 nm. Misurare il contenuto di Dox utilizzando un saggio fluorimetrico, disperdendo le particelle in acqua ultrafiltrata, deionizzata o PBS, centrifugandole a 25 °C, 360 x g per 3 minuti e quindi determinando la quantità di farmaco libero valutando la fluorescenza del surnatante a 590 nm con una curva di calibrazione (intervallo di linearità per la concentrazione di Dox: 2-20 μmol/mL, R² = 0,99).
      NOTA: Sottrarre il valore ottenuto dalla concentrazione totale di Dox per ottenere la quantità incapsulata di Dox. Esegui l'esperimento in triplice copia. L'efficienza di incapsulamento Dox risulta del 28% ± 2%, calcolata dividendo la quantità di farmaco di Dox nei DM per il contenuto totale di Dox distribuito.
   6. Eseguire esperimenti di rilascio di Dox nel tempo, centrifugando e ripetendo la procedura come al punto 1.2.3 per ottenere la percentuale di Dox rilasciata nel surnatante rispetto al numero di quelli incapsulati. Dopo la prima determinazione, ripetere la procedura diminuendo la velocità di centrifugazione a 280 x g per evitare la rottura dei MD. Tracciare una curva di rilascio nel tempo. Verificare che la concentrazione di Dox rilasciata entro 24 h nel surnatante raggiunga un massimo del 20%.
   7. Misurare il potenziale ζ a 37 °C utilizzando un apparecchio dedicato (es. NanoZetaSizer) e verificare che i valori ottenuti siano intorno ai 90-100 mV.

2. Fabbricazione di sferoidi in substrati non adesivi microstampati

1. Microstampi per colata
   1. Posizionare piccoli stampi 3D e 1 g di polvere di agarosio puro in contenitori adatti alla sterilizzazione. Autoclavarli per 30 minuti con ciclo a secco (121 °C).
   2. In una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 ml di soluzione salina allo 0,9% (NaCl) al flacone di vetro contenente agarosio sterilizzato e metterlo in un forno a microonde per far bollire e sciogliere la polvere. Lasciare raffreddare l'agarosio fuso a 60 °C e aggiungere 500 μl a ciascun microstampo evitando la creazione di bolle durante il pipettaggio.
      AVVERTENZE: L'agarosio fuso può causare gravi ustioni cutanee. Sono necessari dispositivi di protezione individuale adeguati.
   3. Rimuovere l'agarosio gelificato flettendo con cura lo stampo e rimuovendo il substrato appena formato. Mettere i substrati in una piastra a 12 pozzetti e aggiungere 2 ml di terreno di coltura fresco per pozzetto. Incubare per almeno 15 minuti per equilibrare ogni substrato.
      NOTA: Preparare in anticipo il terreno di coltura e passarlo attraverso un filtro da 0,22 μm per rimuovere eventuali particelle o contaminanti.
2. Semina delle cellule
   1. Coltura di cellule MDA-MB 231 con terreno completo (DMEM integrato con 1% Pen/Streptococco, 10% FBS e 1% L-Glu) in un incubatore per colture cellulari a 37 °C, 5% CO₂. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza in un pallone T75, scartare il terreno, sciacquare con 4 mL di DPBS e aggiungere 3 mL di tripsina/EDTA. Posizionare il pallone nell'incubatrice e attendere che le cellule si stacchino. Ispezionare il distacco al microscopio invertito (a 20x) ogni 5 minuti.
   2. Raccogliere le cellule staccate con 3 mL di DPBS con il 10% di FBS in una provetta da 15 mL e centrifugare a 235 x g per 10 min. Scartare il surnatante contenente sia DPBS che tripsina/EDTA e risospendere il pellet di cellule in 3 mL di terreno fresco. Pipettare 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di tripanoblu e contare le cellule utilizzando una camera Neubauer.
      NOTA: Durante la raccolta delle cellule, neutralizzare la tripsina/EDTA con DPBS contenente il 10% di FBS per evitare che la tripsina danneggi le cellule durante la fase di centrifugazione.
   3. Per ottenere un diametro nominale dello sferoide di 50 μm (~15 cellule/sferoide), diluire la sospensione cellulare a una concentrazione finale di 3.840 cellule/190 μL, ottenendo 256 sferoidi nello stampo piccolo. In alternativa, per un diametro di sferoide di 200 μm (~1.000 cellule/sferoide) diluire fino a una concentrazione finale di 81.000 cellule/190 μL, ottenendo 81 sferoidi nello stampo grande, secondo le istruzioni del produttore.
   4. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 12 pozzetti e inclinare i substrati per rimuovere con cautela il terreno dalla camera di semina cellulare. Aggiungere 190 μL di sospensione cellulare a ciascun substrato (in modo goccia a goccia) e attendere che le cellule si stabilizzino per 10 minuti nell'incubatore di coltura tissutale.
   5. Aggiungere 2 mL del terreno circostante per pozzetto e riposizionare il multipozzetto nell'incubatore. Ispezionare la formazione di sferoidi ogni 24 ore. Sostituire con un mezzo nuovo quando necessario.
3. Raccolta e lavorazione degli sferoidi
   1. Mettere una piastra di Petri da 35 mm contenente 2 ml di terreno fresco nell'incubatore per equilibrare per 10-15 minuti.
   2. Rimuovere il terreno di coltura cellulare che circonda il substrato. Con una pinzetta sterile, rimuovere il substrato dal pozzetto e capovolgerlo nella capsula di Petri. Picchiettare delicatamente il fondo del substrato per far cadere gli sferoidi per gravità.
   3. Rimettere la capsula di Petri contenente gli sferoidi nell'incubatrice per un'ulteriore lavorazione. I passaggi del protocollo per la fabbricazione degli sferoidi sono mostrati nella Figura 2.

3. Trattamento degli sferoidi

1. Rimuovere il surnatante dallo stampo e sostituirlo con 200 μl di dispersione di Dox@DDAB-MDs, preparato come descritto al punto 1.1.6.
2. Dopo 5 minuti, aggiungere 2 ml/pozzetto di terreno circostante per equilibrare. Trascorso il tempo di trattamento desiderato, procedere come indicato al punto 2.1.

4. Caratterizzazione delle dimensioni e della morfologia degli sferoidi

1. Controllare le dimensioni dello sferoide dopo il tempo di incubazione desiderato con un obiettivo 40x combinato con il software di elaborazione delle immagini del microscopio.
2. Misurare le dimensioni di almeno 10 sferoidi per raccogliere dati sufficienti per statistiche adeguate e analizzare i loro volumi come riportato nel passaggio 7.

5. Saggio di proliferazione/vitalità: microscopia a fluorescenza con colorazione di cellule vive

NOTA: Seguire le istruzioni per la fabbricazione degli sferoidi fino al passaggio 2.2.5.

1. Rimuovere il surnatante dallo stampo e sostituirlo con 200 μL di calceina-AM da 4 μM in PBS e incubare per 3 ore a temperatura ambiente al buio. Durante gli ultimi 20 minuti di incubazione, aggiungere 10 μg/mL di ioduro di propidio per colorare le cellule morte.
2. Raccogliere gli sferoidi capovolgendo il substrato nella piastra di Petri come per il passaggio 2.3.2.
3. Imaging degli sferoidi in soluzione di colorazione utilizzando CLSM con obiettivi 40x/60x e un laser Ar+, impostando il guadagno e il foro stenopeico in modo appropriato per ottenere immagini focalizzate.

6. Analisi e acquisizione delle immagini

1. Immagini 2D trasmesse e confocali
   1. Aprire il software confocale (File supplementare A) e selezionare l'obiettivo (60x, 40x, ecc.). Nel pannello di destra fare clic su Trans per selezionare il canale di trasmissione.
   2. Fare clic su Live per visualizzare l'immagine e cercare la messa a fuoco ottimizzata. Fare clic su Singolo per interrompere l'acquisizione.
   3. Per le immagini confocali, fare clic su Canali laser rossi o verdi a seconda del colorante fluorescente utilizzato. Nella sezione stenopeica, selezionare l'apertura a S nel menu a discesa e impostare la sezione del guadagno su 6,00 B.
   4. Fare clic su Live e impostare l'apertura e il guadagno del foro stenopeico per ottimizzare il contrasto. Clicca su Singolo per interrompere l'acquisizione e salvare l'immagine. Sovrapponi l'immagine di trasmissione e confocale selezionando il canale corretto nella barra degli strumenti in alto.
2. Immagini 3D confocali
   1. Fare clic su Z nel pannello di destra (File supplementare B). Fare clic sul pulsante rosso per ripristinare le impostazioni.
   2. Seleziona la sezione Ref , clicca su Live e cerca il piano mediano all'interno dell'oggetto spostando il focus. Seleziona la sezione superiore e sposta la messa a fuoco verso l'alto fino a quando l'oggetto non è sfocato e scompare.
   3. Ripetere il passaggio 6.2.2 per la sezione inferiore spostandosi verso il basso della messa a fuoco.
   4. Impostare la dimensione del passo su 0,75 μm. Fare clic su Z-stack e poi su Singolo per avviare la scansione. Salva le immagini in formato .ics.
3. Immagini ottiche e analisi
   1. Apri il software del microscopio ottico, cattura l'immagine con una messa a fuoco lunga 40x o un obiettivo 20x premendo Riproduci nella barra degli strumenti in alto. Premere Stop e salvare l'immagine.
   2. Nella barra degli strumenti in alto fare clic su Visualizza, Controllo analisi, Annotazioni e Misure aprendo un pannello con diverse opzioni (File supplementare C). Nel pannello Annotazioni e misure selezionare Semiasse e fare clic su Ellisse.
   3. Nella ricerca immagini, cerca l'asse che si adatta meglio alla forma dell'oggetto e premi Invio sulla tastiera per trasferire il valore ottenuto sulla tabella del pannello di destra.
   4. Ripetere il passaggio 6.3.3 per almeno 10 oggetti per ottenere dati sufficienti. Fare clic su Esporta in foglio dati Excel per esportare i dati e salvarli.
4. Visualizzazione di immagini 3D Z-Stack e calcolo numerico del volume
   1. Aprire l'immagine 3D acquisita con la microscopia confocale nel software del microscopio ottico (file supplementare D).
   2. Per vedere la ricostruzione 3D, clicca su Mostra Vista Volume nella barra degli strumenti dell'immagine; L'oggetto può essere ruotato in qualsiasi direzione facendo clic con il tasto sinistro del mouse. Per selezionare una parte del volume, continuare a premere ctrl + tasti sinistro del mouse (File supplementare E).
   3. Premere il pulsante x sulla tastiera per scattare un'istantanea dell'immagine 3D e salvarla.
   4. Per calcolare il volume dell'oggetto, fare clic su Misura, Misure 3D dell'oggetto aprendo un pannello (File supplementare, Immagine F). Fare clic sulla barra degli strumenti del pannello Definisci soglia 3D e impostare la soglia ottimizzata utilizzando anche i filtri lisci e puliti (File supplementare, Immagine G). Cliccare su OK ottenendo nel pannello di misure dell'oggetto 3D diversi parametri, tra cui il volume.
   5. Fare clic su Esporta in Excel per esportare i dati e salvarli.

7. Analisi dei dati sferoidi

1. Per i calcoli del volume degli sferoidi, approssimare la struttura 3D con un ellissoide prolato, stimando l'asse maggiore e minore attraverso la proiezione 2D come mostrato nell'inserto della Figura 3.
2. Convalidare l'approssimazione dell'ellissoide prolato attraverso un confronto tra il volume calcolato numericamente come mostrato nel passaggio 6.4 e la formula del volume dell'ellissoide prolato con b>a=c dove a, b e c sono gli assi dell'ellissoide).
3. Calcolare il volume medio di almeno 10 sferoidi e le rispettive deviazioni standard. Se la distribuzione del volume dello sferoide è normale, applicare il test di Dixon per identificare e rifiutare il valore anomalo. Successivamente, calcolare il rapporto in volume tra i campioni trattati e quelli trattati insieme alla propagazione dell'errore, come riportato nella Figura 6A.

Risultati

I Dox@DDAB-MD sono stati sviluppati secondo il protocollo (Sezione 1) come descritto schematicamente nella Figura 1. I MD ottenuti sono costituiti da un monostrato di DDAB che incapsula il nucleo DFP (Figura 1A). La carica cationica del DDAB e la procedura di sonicazione evitano la formazione di strati multilamellari DDAB impilati all'interfaccia DFP e acqua²³.

La micrografia CLSM (

Discussione

Per migliorare l'efficacia delle antracicline come farmaci antitumorali, questo lavoro presenta la formazione di goccioline di PFC sgusciate DDAB che incapsulano il farmaco chemioterapico doxorubicina (Dox) e l'effetto di tale formulazione che interagisce con le cellule di carcinoma mammario triplo negativo altamente aggressive, MDA-MB-231.

Costituzione di DOX@DDAB-DM
I MD caricati con Dox sono stati formulati con il metodo dell'insonazione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
µ-piastra di Petri	Ibidi	81156	altezza 35mm, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-Decafluoropentano	Sigma-Aldrich	138495-42-8	b.p. 55° C
Piastra di coltura a 12 pozzetti	Corning
Provetta da centrifuga da 15 ml	Falcon	89039-664
Piastre di Petri 3D 12:256	Microtessuti (Sigma-Aldrich)	Z764000-6EA	Piccole
piastre di Petri 3D 12:81	Microtessuti (Sigma-Aldrich)	Z764019-6EA	Grande
incubatore di coltura CO2 al 5%, 37° C	Thermo Scienific		HERAcell 150i
50 ml provetta da centrifuga	Falcon	352070
Armadio di sicurezza biologica, II livello
Calcein	Sigma-Aldrich
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	148504-34-1	4mM soluzione stock in
DMSO cam sCMOS Andor Zyla 4.2	Andor Instruments
Centrifuga Hettich Universal 320R	Hettich Lab. Technology
DAPI	SIgma-Aldrich
Dimetildiottadecilammonio bromuro in polvere	Sigma-Aldrich	3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	15-013-CV
Doxorubicina cloridrato	Sigma-Aldrich	25316-40-9
DPBS (PBS modificato di Dulbecco)	Corning	21-030-CV	pH 7,4
Etanolo 70%	Sigma-Aldrich
EZ-C1 ecliplse digitale	Nikon Instruments		Versione argento 3.91
Siero fetale bovino (FBS)	Corning	35-079-CV
Goniometro BI-200SM	Brookhaven Instruments Corporations
Laser Ar+	Spectra Physics
Laser He-Ne	Melles-Griot
L-Glutammina	Corning	25-005-CI
Mcroscopio Nikon Eclipse Ti	Nikon Instruments
MDA-MB 231 linea cellulare	ATCC
Microsoft Excel	Microsoft
Lettore di micropiastre Spark	Tecan gruppo
NanoZetaSizer ZS	Malvern Instruments LTD
Neubauer camera		718605
software NIS Elements	Nikon Instruments		AR 4.30
Pen/Strepto	Corning	30-002-CI
Fotocorrelatore BI-9000 AT	Brookhaven Instruments Corporations	62927-1
Fotometro HC120	Brookhaven Instruments Corporations	N° 1275
Pipette	Gilson
Propidium Iodide	SIgma-Aldrich
, varie dimensioni	Corning
Laser a stato solido	Suwtech Laser	N° 22368
T25 Palloni	Sarstedt	83.3910.002
T75 Palloni	Sarstedt	83.3911.002
Tripsina/EDTA 0,05%	EuroClone	ECB3052D
Vibra-Cell VCX-400	Sonics & Materiali, incluso
		d'acqua	37° E