L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale

Sommario

I modelli PDX di metastasi del sistema nervoso centrale rappresentano le caratteristiche fenotipiche e molecolari delle metastasi umane, rendendoli modelli eccellenti per studi preclinici. Qui viene descritto come stabilire i modelli PDX e le vie di inoculazione meglio utilizzate per gli studi preclinici.

Abstract

Lo sviluppo di nuove terapie per le metastasi del sistema nervoso centrale (SNC) è stato ostacolato dalla mancanza di modelli preclinici che rappresentino accuratamente la malattia. I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di metastasi del SNC hanno dimostrato di rappresentare meglio le caratteristiche fenotipiche e molecolari della malattia umana, oltre a riflettere meglio l'eterogeneità e la dinamica clonale dei tumori dei pazienti umani rispetto ai modelli storici di linee cellulari. Esistono più siti che possono essere utilizzati per impiantare tessuto derivato dal paziente durante l'impostazione di studi preclinici, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi e ciascuno adatto per lo studio di diversi aspetti della cascata metastatica. Qui, il protocollo descrive come stabilire modelli PDX e presentare tre diversi approcci per l'utilizzo di metastasi del SNC modelli PDX negli studi pre-clinici, discutendo ciascuna delle loro applicazioni e limitazioni. Questi includono l'impianto del fianco, l'iniezione ortotopica nel cervello e l'iniezione intracardiaca. L'impianto sottocutaneo del fianco è il più facile da monitorare e, quindi, il più conveniente per gli studi preclinici. Inoltre, sono state osservate metastasi al cervello e ad altri tessuti dall'impianto del fianco, indicando che il tumore ha subito più fasi di metastasi, tra cui intravasazione, stravaso e colonizzazione. L'iniezione ortotopica nel cervello è l'opzione migliore per ricapitolare il microambiente del tumore cerebrale ed è utile per determinare l'efficacia dei biologici per attraversare la barriera emato-encefalica (BBB), ma bypassa la maggior parte dei passaggi della cascata metastatica. L'iniezione intracardiaca facilita le metastasi al cervello ed è anche utile per studiare il trofismo degli organi. Mentre questo metodo rinuncia ai primi passaggi della cascata metastatica, queste cellule dovranno ancora sopravvivere alla circolazione, stravasare e colonizzare. L'utilità di un modello PDX, quindi, è influenzata dalla via di inoculazione del tumore e la scelta di quale utilizzare dovrebbe essere dettata dalla questione scientifica e dagli obiettivi generali dell'esperimento.

Introduzione

L'incidenza di metastasi al sistema nervoso centrale (SNC) è aumentata negli ultimi anni ^1,2,3. Le terapie tradizionali per le metastasi del SNC, come la resezione del tumore, la radioterapia dell'intero cervello e la radiochirurgia stereotassica, sono state in gran parte palliative e raramente curative e possono portare a effetti collaterali debilitanti, come il deterioramento cognitivo¹. Recentemente, molte nuove terapie mirate e immunologiche sono state sviluppate per il trattamento delle metastasi del SNC che mostrano la promessa di essere trattamenti più efficaci, pur avendo meno effetti collaterali⁴.

La traduzione dei risultati preclinici in endpoint clinici significativi richiede spesso strategie di modellazione efficaci e predittive. Storicamente, i modelli di xenotrapianto su linea cellulare erano lo standard per la ricerca preclinica nella ricerca sulle metastasi del SNC. Tuttavia, questi modelli di linee cellulari non riflettono il vero comportamento tumorale del tumore ospite o rappresentano l'eterogeneità istologica o molecolare della malattia. Inoltre, i modelli di linee cellulari sono in grado di adattarsi alle condizioni di crescita in vitro e, quindi, perdono le proprietà originali del tumore ospite. Gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX), che innestano il tumore di un paziente in un topo immunodeficiente o umanizzato, sono sempre più utilizzati nella ricerca traslazionale sul cancro. I ricercatori hanno dimostrato che i modelli PDX di solito possono ricapitolare fedelmente la crescita tumorale, le caratteristiche istologiche, mantenere l'eterogeneità del tumore, il potenziale metastatico e le caratteristiche genetiche molecolari. Inoltre, i modelli PDX sono prognostici in cui il periodo di latenza tumorale PDX è correlato con la sopravvivenza globale del paziente e hanno anche dimostrato di prevedere con precisione la risposta terapeutica negli studi sui pazienti ^5,6.

C'è stata un'emergenza di metastasi del SNC PDX. Per lo più, questi sono stati sviluppati rappresentando tumori provenienti da una singola origine, come il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) ⁷, il cancro al seno^8,9 e il melanoma ^10,11. Più recentemente, è stata sviluppata e caratterizzata una vasta e diversificata collezione di modelli PDX, che rappresentano otto diversi sottotipi istologici¹². È stato dimostrato che i modelli PDX per le metastasi del SNC assomigliano molto al loro tumore originale del paziente, sia istologicamente che molecolarmente e hanno anche dimostrato differenze istologiche uniche e somiglianze^10,12. Inoltre, mentre la maggior parte dei modelli PDX di metastasi del SNC mantengono l'eterogeneità clonale dei tumori umani, alcuni hanno mostrato evidenza di successione clonale¹², rendendoli ideali anche per studiare la resistenza alle terapie monitorando i cambiamenti clonali dopo il trattamento.

I protocolli qui descritti delineano i metodi di instaurazione del PDX e varie vie di inoculazione utilizzate negli studi preclinici sulle metastasi del SNC (Figura 1). Questi metodi di impianto variano nella loro capacità di imitare la crescita e le metastasi. Qui, il protocollo evidenzia le applicazioni per ogni via di impianto e dimostra come potrebbero essere utilizzate per lo studio delle metastasi del SNC.

Protocollo

Di seguito sono riportati una serie di protocolli passo-passo utilizzati sia per stabilire modelli PDX mediante impianto sottocutaneo del fianco sia per impostare studi preclinici che consentono di testare i trattamenti, che possono aiutare a valutare i cambiamenti biologici e le varie fasi della cascata metastatica. Tutti gli studi e i modelli hanno utilizzato topi NOG femmina di 3-8 settimane. Tutti i campioni di tessuto sono stati raccolti sotto consenso informato in conformità con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).

1. Istituzione e propagazione di modelli PDX mediante impianto del fianco

1. Creazione di modelli PDX
   1. Dopo la resezione chirurgica del tumore dal paziente in sala operatoria, conservare i tessuti tumorali freschi in una soluzione adatta (come DMEM) e posizionarlo immediatamente sul ghiaccio. Utilizzare un eccesso di soluzione di conservazione (>10 ml) per assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso.
   2. Trasferire il tessuto in una capsula di coltura tissutale e risciacquare con 5 mL di DPBS.
      NOTA: Questo passaggio deve essere condotto in un armadio di biosicurezza utilizzando tecniche asettiche. Devono essere prese precauzioni indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) per la protezione contro possibili agenti infettivi umani.
   3. Rimuovere le regioni necrotiche dal tumore.
      NOTA: Questo può essere riconosciuto come una regione bianca molle verso il centro del tessuto.
   4. Tagliare il tessuto rimanente in pezzi di circa 2 x 2 x 2 mm.
   5. Trasferire i tessuti in una provetta da microcentrifuga contenente la matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita e conservarli su ghiaccio. Assicurarsi che venga utilizzata una matrice di membrana basale sufficiente (>200 μL) per immergere completamente ogni pezzo di tessuto.
   6. Crioconservare i tessuti rimanenti che non saranno impiantati secondo il protocollo descritto nella fase 1.3.
   7. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isoflurano e ossigeno al 2-5%. Una volta anestetizzata, trasferire l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia all'1,5-2,5% di isoflurano con un apporto continuo di ossigeno. Confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale. Applicare l'unguento oftalmico veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l'intervento chirurgico. Fornire supporto termico per l'animale durante tutta la procedura fino a quando l'animale non si riprende.
   8. Identificare il sito di impianto sul mouse.
      NOTA: Questo dovrebbe essere sul fianco destro o sinistro del topo, generalmente segnato lateralmente sul lato della regione addominale, caudale alla gabbia toracica.
   9. Per preparare l'area chirurgica, radere la pelliccia e disinfettare con tre scrub alternati di iodio povidone e etanolo al 70%.
   10. Usando una pinza, sollevare la pelle del topo e praticare un'incisione di 0,5-1 cm sulla pelle.
   11. Inserire lentamente un paio di forbici chirurgiche sotto la pelle nel sito di incisione per creare una tasca (profonda 0,5-1 cm) nello spazio sottocutaneo.
   12. Posizionare con attenzione un pezzo di tumore nella tasca e spingerlo spingerlo sul fondo della tasca per evitare che il tumore scivoli fuori.
   13. Chiudere l'incisione utilizzando suture chirurgiche in nylon 4-0.
       NOTA: Possono essere utilizzati anche altri metodi di chiusura della ferita come punti di sutura non assorbibili o assorbibili e clip per ferite.
   14. Trasferire il mouse nella gabbia e monitorare il recupero dell'animale dall'anestesia, fino a quando non è ambulatoriale.
       NOTA: Gli analgesici non sono necessari, ma possono essere somministrati se si osserva dolore nei topi.
   15. Monitorare settimanalmente la crescita del tumore. È previsto un tumore per topo.
       NOTA: Il volume del tumore al trapianto sembrerà inizialmente diminuire, ma questo non è motivo di preoccupazione. Si ritiene che un tumore abbia preso una volta che diventa palpabile ed entra in una fase di crescita logaritmica. Questo primo passaggio rappresenta la generazione F0.
   16. Una volta che i tumori iniziano a crescere, misurare i tumori tre volte alla settimana. Misurare la lunghezza e la larghezza dei tumori con un calibro. Per calcolare il volume del tumore, utilizzare la formula: lunghezza x larghezza x larghezza / 2.
   17. Eutanasia i topi impiantati con tumori PDX quando i tumori sono superiori a 15 mm di diametro utilizzando il lato più lungo del tumore. Eseguire l'eutanasia per inalazione di CO 2 in una camera di induzione di CO₂, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario.
   18. Resecare il tumore dal fianco dell'animale facendo un'incisione. Sezionare delicatamente il tumore asportato con forbici smussate e pinze. Per fare questo, prima tagliare la pelle sopra il tumore, quindi tagliare il tumore lontano dallo strato muscolare sottostante.
   19. Trasferire il tessuto tumorale a >10 ml di una soluzione di conservazione adatta (come DMEM). Posizionalo immediatamente sul ghiaccio. Questo tumore può essere crioconservato o passato a un altro gruppo di topi. Considera questo passaggio come F1.
       NOTA: il passaggio di nuovo renderebbe il passaggio del tumore F2 e così via.
2. Propagazione dei modelli PDX
   1. Inizia con il tumore resecato tenuto in soluzione di conservazione dal punto 1.1.19.
   2. Trasferire il tessuto in una piastra di coltura tissutale e risciacquare con 5 mL di DPBS.
   3. Rimuovere le regioni necrotiche dal tumore.
   4. Tagliare il tessuto in pezzi di circa 2 x 2 x 2 mm.
   5. Trasferire i tessuti in una provetta da microcentrifuga contenente matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita (>200 μL) e conservarli su ghiaccio.
   6. Crioconservare il tessuto rimanente che non viene utilizzato per la propagazione secondo il protocollo descritto al punto 1.3.
   7. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isoflurano e ossigeno al 2-5%. Una volta anestetizzata, trasferire l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia all'1,5-2,5% di isoflurano con un apporto continuo di ossigeno. Confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale. Applicare l'unguento oftalmico veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l'intervento chirurgico. Fornire supporto termico per l'animale durante tutta la procedura fino a quando l'animale non si riprende.
   8. Identificare il sito di impianto sul mouse.
      NOTA: Questo dovrebbe essere sul fianco destro o sinistro del topo, generalmente nella regione addominale, caudale alla gabbia toracica.
   9. Per preparare l'area chirurgica, radere la pelliccia e disinfettare con tre scrub alternati di iodio povidone e etanolo al 70%.
   10. Fai un'incisione di 0,5-1 cm su un fianco del mouse.
   11. Inserire lentamente un paio di forbici chirurgiche sotto la pelle in corrispondenza dell'incisione per creare una tasca (profonda 0,5-1 cm) nello spazio sottocutaneo.
   12. Posizionare con attenzione un pezzo di tumore nella tasca e spingerlo sul fondo della tasca per evitare che il tumore scivoli fuori.
   13. Chiudere l'incisione utilizzando suture chirurgiche in nylon 4-0 o altri metodi di chiusura della ferita.
   14. Trasferire il topo nella gabbia e monitorare il suo recupero dall'anestesia, fino a quando non è ambulatoriale.
       NOTA: Gli analgesici non sono necessari, ma possono essere somministrati se si osserva dolore nei topi.
   15. Durante la latenza (fase di non crescita), monitorare settimanalmente la crescita del tumore. È previsto un tumore per topo.
       NOTA: Il volume del tumore al trapianto sembrerà inizialmente diminuire, ma questo non è motivo di preoccupazione. Un tumore è considerato essere preso una volta che diventa palpabile e inizia a crescere continuamente.
   16. Una volta che i tumori iniziano a crescere, misurare i tumori tre volte alla settimana. Misurare la lunghezza e la larghezza dei tumori con un calibro. Calcola il volume del tumore usando la formula: lunghezza x larghezza x larghezza / 2.
   17. Eutanasia i topi impiantati con tumori PDX quando i tumori sono superiori a 15 mm di diametro utilizzando il lato più lungo del tumore. Eseguire l'eutanasia per inalazione di CO2 in una camera di induzione di CO2, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario.
   18. Resecare il tumore dal fianco dell'animale facendo un'incisione e sezionando delicatamente il tumore con forbici smussate e pinze.
   19. Trasferire il tessuto tumorale a >10 ml di una soluzione di conservazione adatta (come DMEM) e quindi posizionare immediatamente su ghiaccio.
3. Crioconservazione dei tumori PDX
   1. Eutanasia i topi impiantati con tumori PDX quando i tumori sono superiori a 15 mm di diametro utilizzando il lato più lungo del tumore. Eseguire l'eutanasia per inalazione di CO 2 in una camera di induzione di CO₂, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario.
   2. Resecare il tumore dal fianco dell'animale facendo un'incisione e sezionando delicatamente il tumore con forbici smussate e pinze.
   3. Trasferire il tessuto tumorale a >10 ml di una soluzione di conservazione adatta (come DMEM) e quindi posizionare immediatamente su ghiaccio.
   4. Trasferire il tessuto in una piastra di coltura tissutale e risciacquare con 5 mL di DPBS.
   5. Rimuovere le regioni necrotiche dal tumore.
   6. Tagliare il tessuto in pezzi di circa 2 x 2 x 2 mm.
   7. Trasferire il tessuto in criotubi contenenti il 20% di DMEM, il 70% di FBS e il 10% di DMSO.
   8. Trasferire i criotubi in un contenitore di crioconservazione e metterli in un congelatore a -80 °C.
   9. Quando i criotubi vengono raffreddati a -80 °C, trasferirli in un deposito di azoto liquido.

2. Vie di inoculazione per studi preclinici

1. Impianto sottocutaneo del fianco.
   NOTA: L'impianto sottocutaneo del fianco può essere utilizzato per facilità e può essere utile per studiare tutte le fasi della cascata metastatica.
   1. Utilizzare tumori PDX in crescita o tumori PDX crioconservati per l'impianto iniziale del fianco.
   2. Per i tumori PDX in crescita, eutanasia i topi utilizzando un metodo approvato IACUC quando i tumori sono superiori a 15 mm di lunghezza; resecare il tumore e trasferire il tessuto tumorale in una soluzione di conservazione adatta (come DMEM) e posizionare immediatamente sul ghiaccio.
   3. Per i tumori PDX crioconservati, scongelare rapidamente il tessuto PDX crioconservato immergendolo in bagnomaria a 37 °C.
   4. Seguire i passaggi 1.2.2-1.2.19.
2. Impianto ortotopico mediante iniezione intracranica nel cervello.
   NOTA: Questo modello può essere utilizzato per testare l'efficacia dei farmaci per attraversare la BBB e per studiare la colonizzazione tumorale. Questa sezione fa riferimento principalmente all'uso del kit di dissociazione tumorale (vedere Tabella dei materiali). Diversi tipi di tessuto richiedono diversi protocolli di dissociazione. Si consiglia all'utente di testare e ottimizzare il protocollo per massimizzare l'efficienza di dissociazione.
   1. Eutanasia i topi impiantati con tumori PDX utilizzando un metodo approvato IACUC quando i tumori sono più lunghi di 15 mm.
   2. In condizioni sterili in un armadio di biosicurezza, resecare chirurgicamente i tumori PDX e conservare in DMEM su ghiaccio.
   3. Preparare la soluzione di dissociazione nel tubo appropriato aggiungendo la miscela enzimatica nel DMEM come indicato dal protocollo del produttore.
   4. Lavare il tumore in 5 mL DPBS in un piatto di coltura tissutale.
   5. Rimuovere le regioni necrotiche dal tumore.
   6. Tagliare il tumore in piccoli pezzi di 2-4 mm di lunghezza.
   7. Trasferire i pezzi del tumore nel tubo contenente la miscela enzimatica.
   8. Collegare il tubo al dissociatore tissutale ed eseguire il programma adatto al tipo di tessuto. Consultare il protocollo del produttore per il programma appropriato da eseguire e il tempo di dissociazione richiesto.
   9. Dopo il completamento del programma, filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm.
   10. Lavare il filtro cellulare con 20 ml di DMEM.
   11. Centrifugare le cellule dissociate a 300 x g per 7 minuti.
   12. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in DPBS.
   13. Contare le cellule e diluire alla concentrazione richiesta.
   14. Impostare il telaio stereotassico secondo le istruzioni del produttore e preparare una piastra riscaldante per i mouse. Sanificare tutte le aree con etanolo al 70%.
   15. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isoflurano e ossigeno al 2-5%. Una volta anestetizzata, trasferire l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia all'1,5-2,5% di isoflurano con un apporto continuo di ossigeno. Confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale. Applicare l'unguento oftalmico veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l'intervento chirurgico. Fornire supporto termico per l'animale durante tutta la procedura fino a quando l'animale non si riprende.
   16. Preparare l'area chirurgica radendo la pelliccia sulla testa del topo per esporre il cuoio capelluto.
   17. Fornire al topo l'analgesico appropriato, come una dose di 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (SR) somministrata per iniezione sottocutanea.
   18. Trasferire il mouse sul frame stereotassico. Assicurarsi che il mouse stia mordendo il blocco del morso. Utilizzare le barre auricolari per fissare saldamente la testa del mouse.
       NOTA: il mouse è fissato correttamente se la testa non si muove quando viene spinta delicatamente con una pinza.
   19. Disinfettare la zona rasata con tre scrub alternati di povidone-iodio ed etanolo al 70%.
   20. Fare un'incisione longitudinale di 5-7 mm sul cuoio capelluto per esporre il cranio e ritrarre il cuoio capelluto.
   21. Raschiare via il periostio con uno strumento chirurgico contundente come una pinza.
   22. Individua il bregma sul cranio.
   23. Posizionare l'ago del fotogramma stereotassico sulla parte superiore del bregma e reimpostare le coordinate su 0 o annotare la coordinata sul braccio.
   24. Spostare il braccio di 1 mm posteriormente (caudalmente) e 1 mm lateralmente, a destra della linea mediana.
   25. Contrassegna questa posizione con un indicatore permanente. Se il braccio contiene una fessura per la siringa, collegare un marcatore alla fessura della siringa per contrassegnare la posizione.
   26. Praticare un piccolo foro di bava nel cranio in questa posizione. Non applicare troppa pressione per evitare di perforare il cervello.
   27. Caricare una siringa Hamilton da 5 μL, 26 G con 5-10 x 10⁴ celle, in un volume di 1-2 μL, e attaccarla al braccio stereotassico.
   28. Inserire lentamente l'ago della siringa di Hamilton di 2 mm nel cervello.
   29. Iniziare a iniettare cellule alla velocità desiderata, di solito 0,2-0,5 μL/min.
   30. Dopo che l'iniezione è completa, ritrarre lentamente l'ago dal cervello.
   31. Riempi il foro di bava con cera ossea.
   32. Chiudere l'incisione con suture chirurgiche o colla chirurgica.
   33. Trasferire nuovamente il mouse nella gabbia e monitorare il suo recupero dall'anestesia.
   34. Monitorare regolarmente le condizioni degli animali e sopprimerli quando vengono raggiunti i criteri dell'endpoint umano nel protocollo approvato.
       NOTA: La crescita tumorale di successo nel cervello provoca il deterioramento delle condizioni dell'animale, che spesso si manifesta con inclinazione della testa, pelo ruvido, corpo curvo, occhi socchiusi, attività ridotta e basso punteggio di condizione corporea (BCS < 2).
   35. Eseguire una necroscopia sugli animali eutanasiati, seguita da un'analisi istologica per confermare la presenza di tumori nel cervello. Registra il tempo necessario dall'impianto all'eutanasia.
3. Impianto di modelli PDX mediante iniezione intracardiaca
   NOTA: Questo modello può essere utilizzato per studiare il tropismo degli organi una volta che le cellule tumorali sono in circolazione. Questa sezione utilizza anche il Kit di Dissociazione Tumore e richiede l'ottimizzazione per tipo di tessuto.
   1. Seguire i passaggi 2.2.1-2.2.13.
   2. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con isoflurano e ossigeno al 2-5%. Una volta anestetizzata, trasferire l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia all'1,5-2,5% di isoflurano con un apporto continuo di ossigeno. Confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale. Applicare l'unguento oftalmico veterinario per prevenire la secchezza degli occhi durante l'intervento chirurgico. Fornire supporto termico per l'animale durante tutta la procedura fino a quando l'animale non si riprende.
   3. Quindi, posizionare il mouse in posizione supina.
   4. Per preparare l'area chirurgica sul torace, radere la pelliccia e disinfettarla con tre scrub alternati di povidone-iodio e etanolo al 70%.
   5. Aspirare 0,5-10 x 10⁵ cellule in una siringa su un ago da 28 G, fino ad un volume di 100 μL.
      NOTA: Il numero di celle richieste varia a seconda dell'aggressività del modello e il numero ottimale di celle deve essere determinato empiricamente per ciascun modello.
   6. Individuare il sito di iniezione (leggermente a sinistra dello sterno del topo e a metà strada tra la tacca sternale e il processo xyphoide).
   7. Inserire l'ago verticalmente nel mouse nel sito di iniezione.
   8. Osservare l'entrata riuscita nel ventricolo sinistro attraverso un riflusso di sangue che entra nella siringa. Erogare lentamente le cellule nel ventricolo sinistro senza muovere l'ago.
   9. Estrarre lentamente l'ago verticalmente dal mouse.
   10. Applicare un pezzo di garza sterile sul sito di iniezione e applicare pressione per circa 1 minuto fino a quando l'emorragia si ferma, pur consentendo il movimento del torace per la respirazione.
   11. Rimuovere il mouse dall'anestesia e lasciarlo recuperare su un pad riscaldato.
       NOTA: Il successo della crescita tumorale si traduce in un deterioramento delle condizioni dell'animale, che spesso si manifesta con pelo arruffato, corpo curvo, occhi socchiusi, attività ridotta e basso punteggio di condizione corporea (BCS < 2).
   12. Monitorare regolarmente le condizioni degli animali e sopprimerli quando vengono raggiunti i criteri dell'endpoint umano nel protocollo approvato.
   13. Eseguire una necroscopia per identificare le metastasi sugli animali eutanasiati, seguita da un'analisi istologica per confermare la presenza di tumori nell'organo bersaglio. Registra il tempo necessario dall'iniezione intracardiaca all'eutanasia.

Risultati

I tumori PDX propagati dal fianco sono i più facili da impiantare, monitorare e resecare ed è generalmente raccomandato per l'instaurazione iniziale e la propagazione dei tumori PDX (Figura 1). Quando si stabiliscono o si propagano tumori PDX, è prudente impiantare tumori in più animali, poiché il tasso di assunzione del tumore può variare e non tutti i pezzi di tumore accoglieranno sempre i topi. Sono stati sviluppati metodi per la creazione e la propagazione delle metastasi del SNC PDX direttamente nel cervello¹³. Tuttavia, questi metodi sono ancora più impegnativi con tassi di assunzione più bassi e i tumori sono significativamente più difficili da propagare e monitorare rispetto all'impianto del fianco.

Se i tumori del paziente non sono prontamente disponibili, i tumori PDX delle metastasi del SNC possono anche essere ottenuti da una varietà di fonti, compresi i depositi di laboratori accademici o aziende commerciali. Dopo aver acquisito i tumori, la prima priorità sarebbe quella di propagare e crioconservare quanto più materiale possibile, assicurando che un gran numero di tumori a basso passaggio siano preservati. Ciò garantisce la disponibilità di materiale sufficiente per un numero indefinito di studi successivi con i modelli PDX. Proprio come le linee cellulari immortalizzate, i tumori PDX dovrebbero essere crioconservati e utilizzati a basso numero di passaggio, poiché la deriva genetica provoca cambiamenti nel fenotipo e nel genotipo dei PDX nel tempo^12,14,15. Indipendentemente dalla fonte dei tumori PDX, è importante eseguire frequenti screening di PDX e colonie di topi per patogeni sia umani che di topo, come l'HIV e l'epatite per l'uomo e Corynebacterium bovis per i topi. Ciò limiterà la diffusione di agenti patogeni indesiderati dal PDX sia all'individuo che li maneggia che ad altri topi nello studio e nel vivaio.

I metodi di impianto qui descritti possono essere utilizzati per studiare la biologia del tumore, valutare molteplici aspetti della cascata metastatica e per studi preclinici. Il principale vantaggio dell'impianto del fianco è la facilità di monitoraggio del tumore nel tempo, poiché i tumori sono visibili e la sua crescita può essere facilmente misurata utilizzando un calibro. Questo metodo può essere un buon punto di partenza per stabilire la fattibilità di un bersaglio farmacologico. L'impianto intracranico è preferibile se la presenza del microambiente cerebrale è importante e potrebbe alterare la crescita o il profilo molecolare del tumore. Inoltre, l'impianto intracranico pone il tumore dietro la barriera ematoencefalica (BBB), rendendolo essenziale per gli studi preclinici che esaminano l'efficacia dei farmaci necessari per attraversare la BEE. Tuttavia, è difficile monitorare la crescita dei tumori PDX e richiede l'imaging radiologico o l'imaging bioluminescente se le cellule sono etichettate. Sapere quando iniziare il trattamento farmacologico preclinicamente richiederebbe dati di imaging per monitorare la crescita o la conoscenza della sopravvivenza media dei topi portatori di un particolare tumore PDX. Inoltre, l'impianto intracranico bypassa tutti i passaggi essenziali della cascata metastatica, rendendolo adatto solo per studiare l'efficacia dei farmaci e il microambiente tumorale all'interno del cervello. Nonostante le differenze nel microambiente tumorale, la morfologia dei tumori PDX è simile indipendentemente dal sito di impianto, come si può vedere in questo tumore PDX (CM04) derivato da una metastasi cerebrale che ha avuto origine da un tumore primario del carcinoma polmonare a piccole cellule (Figura 2). La morfologia del carcinoma polmonare a piccole cellule delle cellule tumorali con piccoli nuclei e citoplasma scarso può essere osservata nel tumore del fianco, nel tumore intracranico e nelle metastasi addominali derivanti dall'iniezione intracardiaca. Inoltre, metastasi spontanee da tumori impiantati nel fianco sono state precedentemente osservate¹², suggerendo che i processi metastatici come l'intravasazione, lo stravaso e la colonizzazione possono essere ricapitolati e studiati nei tumori del fianco che altrimenti non sarebbero possibili con i tumori ortotopici nel cervello. In generale, si osserva che l'impianto del fianco è un metodo adatto per studiare la biologia delle metastasi del SNC e condurre studi preclinici.

L'iniezione intracardiaca è più spesso utilizzata per studiare il trofismo degli organi e il potenziale metastatico dei tumori. Le cellule tumorali iniettate dovrebbero subire diverse fasi della cascata metastatica, tra cui la circolazione sopravvissuta, lo stravaso e la colonizzazione del sito metastatico. Proprio come l'iniezione ortotopica nel cervello, può essere difficile monitorare il progresso delle metastasi tumorali senza imaging radiologico o etichettatura cellulare. Tuttavia, come con l'impianto ortotopico, l'inoculazione di successo provoca un deterioramento delle condizioni degli animali nel tempo man mano che il tumore si diffonde. La Figura 3A mostra le metastasi al cervello dopo iniezione intracardiaca nel modello PDX di metastasi del SNC, M2, che ha avuto origine da un melanoma. L'iniezione intracardiaca del tumore PDX (CM04) ha provocato metastasi alla cavità addominale e al fegato (Figura 3B). Altri organi valutati, come il polmone, il rene e le ovaie non avevano metastasi visibili.

Figura 1: Diagramma di flusso che mostra il flusso di lavoro generale di stabilimento, propagazione e utilizzo di PDX per gli studi preclinici. Per ogni metodo di inoculazione, le fasi della cascata metastatica coinvolta sono elencate sotto ciascun metodo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Istologia dei tumori PDX seguendo diversi metodi di inoculazione. La colorazione con ematossilina ed eosina (H & E) di un tumore PDX metastasi del SNC originato dal carcinoma polmonare a piccole cellule (CM04) impiantato in topi immunocompromessi con i tre metodi ha caratteristiche patologiche e morfologiche tumorali simili ai tumori polmonari a piccole cellule, con piccoli nuclei e citoplasma scarso. Il pannello di iniezione intracardiaca mostra una metastasi addominale. Nidi di cellule di piccole dimensioni e un elevato rapporto nucleare/citoplasmatico sono evidenti in tutte e tre le immagini. Le immagini sono state scattate con uno scanner di diapositive e ingrandite a 10x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Metastasi osservate dopo iniezione intracardiaca. Colorazione H&E di tessuti con metastasi visibili durante la valutazione mediante necroscopia dopo iniezione intracardiaca di (A) M2 e (B) CM04. Le immagini sono state scattate (A) su uno scanner di vetrini e ingrandite a 1x (sinistra) o 20x (destra) o (B) su un microscopio normale con ingrandimento 10x. Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione¹². Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Nel manoscritto attuale, i metodi per la creazione e la propagazione del PDX sono stati dettagliati. Sono stati inoltre dimostrati tre diversi metodi di inoculazione che possono essere utilizzati per l'impostazione di studi preclinici durante la valutazione delle metastasi del SNC. Il metodo di scelta dovrebbe dipendere dagli obiettivi dell'esperimento. In alcuni casi, sarebbe utile utilizzare più di una via di inoculazione. Ad esempio, l'impianto sottocutaneo del fianco fornisce un approccio semplice per studiare l'efficacia di un farmaco sulla crescita tumorale e valutare il farmaco sul suo bersaglio e fornisce anche una visione delle dimensioni del tumore che è facilmente monitorata e misurabile. Tuttavia, una volta stabilita la fattibilità del target e le proprietà di crescita antitumorale, si potrebbe impostare uno studio ortotopico per valutare l'efficacia del biologico per attraversare la BBB e studiare il suo effetto all'interno del microambiente del tumore cerebrale. Inoltre, la sopravvivenza è meglio valutata negli studi di iniezione ortotopica e intracardiaca.

L'iniezione intracranica di metastasi cerebrali modelli PDX è spesso il modello preclinico di scelta a causa della presenza del microambiente cerebrale e della BBB. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che le metastasi cerebrali hanno la capacità di modificare la BBB, che influenza la permeabilità delle molecole al tumore¹⁶. Questi cambiamenti nella BBB non sarebbero riflessi da tumori impiantati per via intracranica e, a causa di ciò, gli studi preclinici sui farmaci potrebbero non riflettere pienamente la risposta dei tumori dei pazienti. Anche con questo avvertimento, l'iniezione intracranica rimane il metodo migliore per testare la permeabilità e l'efficacia dei farmaci per attraversare la BBB in modelli preclinici. Un'altra sfida con i modelli intracranici è che sono difficili per il monitoraggio della crescita tumorale e richiedono l'uso di tecniche di imaging. La trasduzione virale di PDX con marcatori fluorescenti o bioluminescenti è stata tradizionalmente utilizzata, ma può essere difficile da eseguire. Tuttavia, diverse tecniche di imaging sono state sviluppate per l'uso nei topi che non richiedono l'introduzione di marcatori, il che potrebbe migliorare la facilità di monitoraggio di questi tumori cerebrali ortotopici per studi preclinici. Questi includono tecnologie di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la tomografia micro computerizzata (micro-CT). Infine, l'iniezione intracranica potrebbe non riflettere accuratamente il microambiente delle metastasi del SNC al di fuori del cervello, come nelle metastasi leptomeningee. In questo caso, l'iniezione nella cisterna magna potrebbe essere eseguita per rappresentare più accuratamente le metastasi leptomeningee¹⁷.

La caratterizzazione delle caratteristiche fenotipiche e molecolari del modello PDX è importante per selezionare i migliori modelli per gli studi preclinici. La latenza tumorale può variare da 7 a 140 giorni e i tassi di assunzione possono anche essere altamente variabili¹². Il numero ottimale di animali da impiantare e i tempi per iniziare il trattamento dovrebbero essere basati sulle caratteristiche di ciascun modello PDX e devono essere determinati empiricamente. Inoltre, il profilo molecolare dei tumori PDX è importante anche per la selezione dei modelli PDX più rappresentativi per gli studi preclinici. Più il modello rappresenta molecolarmente il tessuto donatore, più è probabile che sia predittivo della risposta clinica. Inoltre, è fondamentale garantire che i bersagli selezionati dai dati umani siano presenti nei PDX scelti per gli studi e siano mantenuti attraverso alcune generazioni, come dimostrato che la successione clonale è associata a un diverso profilo genomico del clone dominante in carica. Alla luce di ciò, i profili fenotipici e molecolari dei tumori PDX delle metastasi del SNC sono stati ampiamente caratterizzati nel corso di più generazioni¹².

Nonostante i numerosi vantaggi dell'utilizzo di modelli PDX per metastasi del SNC, ci sono diverse limitazioni legate al loro utilizzo. In primo luogo, un microambiente tumorale alternativo e soprattutto la mancanza di un sistema immunitario sono limitazioni ben documentate dei modelli PDX¹⁸. Lo xenotrapianto di un tumore umano nei topi provoca la sostituzione dello stroma umano con lo stroma di topo ad ogni passaggio successivo e lo stroma umano viene generalmente completamente sostituito dopo diversi passaggi¹⁹. Tuttavia, le differenze nel microambiente tumorale non si traducono in grandi differenze nel profilo molecolare dei tumori PDX impiantati sul fianco rispetto al tumore originale del paziente¹², suggerendo che i modelli del fianco rappresentano ancora buoni modelli sperimentali per studiare le metastasi del SNC. In secondo luogo, l'uso di animali immunocompromessi provoca una mancanza di infiltrazione di cellule immunitarie nel tumore e una risposta immunitaria generale da parte dell'ospite, limitando un modo fondamentale in cui l'ospite tenta di combattere la crescita del cancro¹². Mentre topi umanizzati innestati con cellule immunitarie umane sono disponibili per studiare le interazioni di specifiche cellule immunitarie con il tumore, ci sono ancora molte domande e controversie sugli approcci, i metodi e l'interpretazione di tali risultati²⁰.

Mentre la maggior parte dei PDX ha dimostrato di essere geneticamente stabile, noi e altri abbiamo dimostrato che in rari casi, anche in assenza di trattamenti o altre pressioni selettive esterne, potrebbero esserci cambiamenti nei cloni dei tumori, come l'acquisizione di cloni minori^12,14,15. Ciò potrebbe comportare cambiamenti drammatici nel profilo molecolare, che alla fine renderebbero il tumore non riflettendo i cloni dominanti nel tumore del paziente¹². Mentre i PDX che mostrano la successione clonale possono essere utilizzati negli studi preclinici, molti geni destinati al targeting (ad esempio, Her2) potrebbero essere persi con la successione clonale. Pertanto, è incoraggiato uno screening frequente dei modelli PDX per determinare se mantengono ancora il profilo molecolare del clone desiderato.

In sintesi, i modelli PDX rappresentano un eccellente sistema modello per lo studio non solo delle metastasi del SNC ma anche di altri tipi di tumore. Lo sviluppo di questi modelli ha dimostrato che riflettono in gran parte il profilo fenotipico, molecolare e l'eterogeneità delle metastasi del SNC umano 8,9,10,12. Servono come modelli efficaci per studiare sia la biologia delle metastasi del SNC che servono anche modelli preclinici fisiologicamente rilevanti, sostituendo modelli di linee cellulari abusati storicamente utilizzati per studi in vivo sulle metastasi del SNC. Indubbiamente, le differenze tra il PDX e il tumore del paziente donatore esistono^12,18. Sapere quali sono queste differenze è importante per una corretta pianificazione ed esecuzione degli studi preclinici. Infine, scegliendo tra diverse vie di inoculazione, i modelli PDX sono versatili nel loro utilizzo consentendo lo studio di molteplici aspetti della malattia. I modelli PDX svolgeranno senza dubbio un ruolo importante nel far progredire la nostra comprensione delle metastasi del SNC e nello sviluppo di nuove terapie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ago 25G VWR		BD305122
70 &; m Filtro cellulare	VWR	21008-952
Salviette etanolo al 70% VWR		470106-486
Cera per ossa	MedVet	W31G-RL
CIEA NOG mouse	Taconic	NOG-F
DMEM	ThermoFisher	11965092
Ethiqa XR (buprenorfina SR)	MWI	072117
FBS	ThermoFisher
gentleMACS C Tube	Miltenyi	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi	130-095-937
Siringa Hamilton	Sigma	20919
Matrigel fattore di crescita ridotto (GFR)	Corning	354230
Unguento oftalmico	MedVet	PH-PURALUBE-VET
PBS/DPBS	ThermoFisher	14040133
Tamponi di iodio povidone	VWR	15648-906
Telaio stereotassico	Stoelting	51730
Trapano chirurgico	Stoelting	58610
Colla chirurgica	MedVet	VG3
Suture chirurgiche	MedVet	MMV-661-V
Siringa	VWR	53548-001
Kit di dissociazione tumorale	Miltenyi	130-095-929