Method Article

Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

DOI:

10.3791/62268

⸱

June 3rd, 2021

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Relazioniamo un saggio semplice, efficiente in termini di tempo e ad alta produttività a base di spettroscopia a fluorescenza per la quantificazione dei filamenti di actina in campioni biologici ex vivo provenienti da tessuti cerebrali di roditori e soggetti umani.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actin, la componente principale del citoscheletro, svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della struttura e della funzione neuronale. Sotto stati fisiologici, l'actina si verifica in equilibrio nelle sue due forme: globulare monomerico (G-actina) e filamentoso polimerizzato (F- actina). Ai terminali sinaptici, l'actina citoscheletro costituisce la base per le funzioni critiche pre e post-sinaptiche. Inoltre, i cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra forme globulari e filamentose di actina) sono strettamente legati alle alterazioni legate alla plasticità nella struttura e nella funzione sinaptica. Qui riferiamo una metodologia modificata basata sulla fluorescenza per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina in condizioni ex vivo. Il saggio utilizza la phalloidina marcata fluorescentmente, una fllotoxina che si lega specificamente ai filamenti di actina (F-actin), fornendo una misura diretta dell'actina filamentosa polimerizzata. Come prova di principio, forniamo prove dell'idoneità del saggio sia negli omogeneati del tessuto cerebrale umano roditore che post mortem. Utilizzando latrunculinA A (un farmaco che depolimerizza i filamenti di actina), confermiamo l'utilità del saggio nel monitoraggio delle alterazioni nei livelli di F-actina. Inoltre, estendiamo il saggio alle frazioni biochimiche dei terminali sinaptici isolati in cui confermiamo una maggiore polimerizzazione dell'actina sulla stimolazione mediante depolarizzazione con K + extracellulareelevato.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'actina della proteina citoscheletricha è coinvolta in molteplici funzioni cellulari, tra cui supporto strutturale, trasporto cellulare, motilità cellulare e divisione. L'actina si trova in equilibrio in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). I rapidi cambiamenti nello stato di polimerizzazione dell'actina (interconversione tra le sue forme G e F) si traducono in un rapido assemblaggio e smontaggio dei filamenti e sono alla base dei suoi ruoli regolatori nella fisiologia cellulare. Actina forma il componente principale della struttura citoscheletricha neuronale e influenza una vasta gamma di funzioni neuronali1,2. Da notare che l'actina citoscheletro forma parte integrante della piattaforma strutturale dei terminali sinaptici. Come tale, è un importante determinante della morfogenesi sinaptica e della fisiologia e svolge un ruolo fondamentale nel controllo delle dimensioni, del numero e della morfologia delle sinapsi3,4,5. In particolare, l'actin polimerizzazione dinamica-depolimerizzazione è un fattore determinante del rimodellamento sinaptico associato alla plasticità sinaptica alla base dei processi di memoria e apprendimento. Infatti, sia le funzioni presnaptiche (come il rilascio di neurotrasmettitori6,7,8,9,10) che le funzioni postsinaptiche (rimodellamento dinamico correlato alla plasticità11,12,13,14)si basano criticamente su cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell'actina citoscheletro.

In condizioni fisiologiche, i livelli di F-actina sono regolati dinamicamente e strettamente attraverso una via multimodale che comporta la modifica posttraslazionale4,15,16 e proteine leganti l'actina (ARP)4,17. Gli ARP possono influenzare la dinamica dell'actina a più livelli (come l'avvio o l'inibizione della polimerizzazione, l'induzione della ramificazione dei filamenti, la recidenza dei filamenti a pezzi più piccoli, la promozione della depolimerizzazione e la protezione dalla depolimerizzazione) e sono a loro volta sotto un rigoroso controllo modulatorio sensibile a vari segnali extra- e intracellulari18,19,20. Tali controlli normativi a più livelli impongono una rigida regolazione della dinamica dell'actina nel citoscheletro sinaptico, per mettere a punto gli aspetti pre e postinaptici della fisiologia neuronale sia allo stato basale che indotto dall'attività.

Dati gli importanti ruoli dell'actina nella fisiologia neuronale, non sorprende che diversi studi abbiano fornito prove di alterazioni della dinamica dell'actina come eventi patogeni critici legati a una vasta gamma di disturbi neurologici tra cui neurodegenerazione, malattie psicologiche e disturbi del neurosviluppo3,21,22,23,24,25,26,27. Nonostante la ricchezza di dati di ricerca che indicano ruoli chiave dell'actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia, tuttavia, permangono lacune significative nella comprensione delle dinamiche dell'actina, in particolare nel citoscheletro sinaptico. Sono necessari ulteriori studi di ricerca per avere una migliore comprensione dell'actina neuronale e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Una delle principali aree di interesse in questo contesto è la valutazione dello stato di polimerizzazione dell'actina. Esistono kit commerciali occidentali a base di gonfiore (kit biochimico di dosaggio G-Actin/F-Actin in vivo; Cytoskeleton SKU BK03728,29) e saggi fatti in casa per la valutazione dei livelli di F-actin6. Tuttavia, poiché questi richiedono l'isolamento biochimico di F-actina e G-actina e poiché la loro successiva quantificazione si basa su protocolli di immunoblotting, possono richiedere molto tempo. Nel presente documento viene descritto un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza adattato da unostudio precedente 30 con modifiche che possono essere utilizzate per valutare sia i livelli basali di F-actina, sia i cambiamenti dinamici nel suo assemblaggio-smontaggio. In particolare, abbiamo modificato in modo efficiente il protocollo originale che richiede campioni adatti per una cuvetta da 1 mL all'attuale formato di piastra da 96 porti. Il protocollo modificato ha quindi ridotto significativamente la quantità di tessuto/campione richiesta per il saggio. Inoltre, forniamo prove che il protocollo è adatto non solo per gli omogeneati del tessuto cerebrale, ma anche per le frazioni subcellulari come terminali sinaptici isolati (sinaptosomi e sinaptoneurosomi). Infine, il saggio può essere utilizzato per tessuti cerebrali roditori appena sezionati e campioni cerebrali umani post mortem conservati a lungo termine. Da notare che, mentre il saggio è presentato in un contesto neuronale, può essere opportunamente esteso ad altri tipi di cellule e processi fisiologici ad essi associati.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali sono state svolte in conformità con le normative del Comitato Etico dell'Università di Otago nella cura e nell'uso degli animali da laboratorio (Protocollo Etico n. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandese. I tessuti cerebrali umani sono stati ottenuti dalla Banca neurologica dei tessuti dell'ospedale Clínic-IDIBAPS BioBank di Barcellona, spagna. Tutti i protocolli di raccolta dei tessuti sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Clínic di Barcellona, e il consenso informato è stato ottenuto dalle famiglie.

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Preparare i seguenti tamponi per l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale e la preparazione di frazione arricchita di terminali sinaptici:
    Tampone di omogeneizzazione: 5 mM HEPES, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M
    Tampone di resuspensione: 5 mM Tris, pH 7.4 integrato con saccarosio 0,32 M
    Tampone di lavaggio: 5 mM Tris, pH 8.1
    1,2 M di saccarosio
    1,0 M di saccarosio
    0,85 M di saccarosio
  2. Aggiungere mix fatto in casa o commerciale di proteasi e inibitori della fosfatasi.
    NOTA: Abbiamo utilizzato la versione senza EDTA del mix completo di inibitore della proteasi (1 compressa per tampone da 10 mL) e cocktail IV inibitore della fosfatasi (1:100; volume: volume).
  3. Preparare i seguenti tamponi e reagenti per la fissazione, la permeabilizzazione e il legame della phalloidina:
    Tampone Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM di glucosio, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% glutaraldeide (soluzione stock)
    Tampone Krebs contenente lo 0,1 % di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloidin in DMSO
    Tampone di Krebs contenente saccarosio 0,32 M
    50 μM latrunculinA A in DMSO (soluzione stock)
    1 M KCl (soluzione stock)
    ATTENZIONE: La phalloidina è tossica (LD50 = 2 mg/kg) e deve essere maneggiata con cura. L'inalazione di glutaraldeide è tossica e deve essere maneggiata in una cappa aspirante.
  4. Conservare i tamponi a 4 °C e phalloidin e latrunculinA A a -20 °C per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: l'archiviazione a lungo termine dei buffer non è consigliata. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. Omogeneizzazione dei tessuti cerebrali

  1. Omogeneizzare il tessuto cerebrale del ratto crioconservato o appena sezionato in 10 volumi di tampone di omogeneizzazione in un tubo di vetro Potter-Elvehjem e pestello sul ghiaccio.
    NOTA: L'omogeneizzazione ottimale si ottiene con 15-20 colpi del pestello a mano per i tessuti cerebrali. Un'omogeneizzazione riuscita può essere confermata dal flusso regolare della sospensione attraverso il tubo di vetro. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  2. Determinare la concentrazione proteica nell'omogeneato utilizzando un saggio di Bradford31.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche test alternativi fatti in casa o commerciali per la stima delle proteine.
  3. Diluire campioni di omogeneato nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL.
    NOTA: In alcuni dei nostri esperimenti, incubamo omogenei con 2 μM latrunculinA A o DMSO (controlli) a 37 °C per 1 h. Per questo, gli omogeneati sono rimorsi in 48 μL di tampone di Krebs, e vengono aggiunti 2 μL di latrunculina A o 2 μL di DMSO. Inoltre, per l'immunoblotting, una piccola quantità di campione (10 μg) viene raccolta dopo l'incubazione.
  4. Fissare i campioni omogenei (sezione 5).

3. Preparazione di terminali nervosi isolati

  1. Preparazione di sinaptosomi
    NOTA: Possono essere utilizzati anche protocollialternativi32 , 33 per i sinaptosomi.
    1. Centrifugare l'omogeneo cerebrale a 1.200 x g per 10 min a 4 °C.
    2. Scartare il pellet, che è la frazione nucleare grezza.
    3. Centrifugare ulteriormente il supernatante (S1) ottenuto nel passaggio 3.1.1 a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
    4. Rimuovere il supernatante (S2), che è la frazione citosolica solubile.
    5. Resuspend il pellet (P2) ottenuto nel passaggio 3.1.3, che è la frazione sinaptosomale grezza nel tampone di resuspensione.
      NOTA: Il volume del tampone di resuspensione dipende dalla quantità di tessuto iniziale e dalla quantità di pellet ottenuta. Ad esempio, quando si inizia con 150-300 mg di tessuti cerebrali, il pellet ottenuto può essere rimorsi in 200 μL di tampone di resuspensione.
    6. Caricare i sinaptosomi grezzi rimescolati su un gradiente di saccarosio discontinuo costituito da volumi uguali di 0,85-1,0-1,2 M di saccarosio.
      NOTA: Usiamo tipicamente 1 mL ciascuno della soluzione di saccarosio (per 150-300 mg di tessuto). Questo può essere cambiato in base a maggiori quantità di tessuto. I gradienti discontinui possono essere realizzati utilizzando una siringa 25G premuta contro la parete interna del tubo ultracentrifugo e una delicata stratificazione degli strati di saccarosio.
    7. Centrifuga a 85.000 x g per 2 h a 4 °C.
      NOTA: A causa dell'alta velocità di centrifugazione, è necessario un ultracentrifugo in grado di creare un vuoto per ridurre il riscaldamento.
    8. Raccogliere la frazione sinaposomica all'interfaccia tra 1,0 e 1,2 M di saccarosio utilizzando una punta di pipetta da 200 μL.
    9. Lavare la frazione sinaptosomale con tampone di lavaggio ghiacciato mediante centrifugazione a 18.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Per il lavaggio, la frazione sinaptosomale ottenuta all'interfaccia di 1,0 e 1,2 M di saccarosio viene raccolta in un tubo fresco da 1,5 ml e viene aggiunto un volume uguale di tampone di lavaggio, garantendo la rimozione di saccarosio elevato dal mezzo.
    10. Lavare nuovamente il pellet sinaptosomale con tampone di omogeneizzazione ghiaccio-freddo a 12.000 g per 10 minuti a 4 °C.
    11. Rimescolare i sinaptosomi nel tampone di omogeneizzazione sul ghiaccio.
      NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.
    12. Determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di Bradford.
    13. Resopendare i sinaptosomi nel tampone di Krebs ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4).
      NOTA: Per la resuspensione, la frazione sinaptosomale viene prima filata a 12.000 x g per 5 minuti a 4 °C e il supernatante (buffer) viene rimosso. Il pellet sinaptosomale viene quindi rimorsinato nel tampone di Krebs mediante pipettazione delicata utilizzando una punta di pipetta da 200 μL.
    14. Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).
  2. Preparazione di sinaptonosomi
    NOTA: Possono essere utilizzati ancheprotocolli alternativi34 , 35 per sinaptonosomi.
    1. Passare l'omogeneo cerebrale attraverso un filtro netto pre-bagnato di dimensioni dei pori di 100 μm in un supporto filtrante utilizzando una siringa da 1 ml.
      NOTA: La pre-bagnatura di tutti i filtri è importante per evitare la perdita di campione e deve essere eseguita utilizzando il buffer di omogeneizzazione. Per questo, il buffer di omogeneizzazione viene passato attraverso i filtri nel supporto del filtro utilizzando una siringa da 1 ml fino al flusso del buffer.
    2. Raccogliere il filtrato (F1) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.
    3. Ripetere il processo (passaggi 3.2.1 e 3.2.2) per la frazione F1 per ottenere il secondo filtrato (F2).
    4. Passare il filtrato F2 attraverso un filtro netto di 5 μm di dimensioni dei pori.
    5. Raccogliere il filtrato (F3) in un tubo pre-refrigerato da 1,5 ml su ghiaccio.
    6. Filtrazione centrifuga F3 a 1.500 x g per 10 min a 4 °C.
    7. Resuspend il pellet (sinaptoneurosomi) nel tampone di Krebs sul ghiaccio ad una concentrazione di 2-3 mg di proteina/mL in un volume di 50 μL (47,5 μL se i sinaptosomi devono essere depolarizzati da KCl; cfr. sezione 4).
      NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.
    8. Stimare la concentrazione proteica usando un saggio di Bradford.
    9. Procedere con la depolarizzazione (sezione 4).

4. Depolarizzazione mediata da KCl di terminali sinaptici isolati

  1. Equilibrare sinaptosomi/sinaptoniurosomi a 37 °C per 5-10 min.
  2. Stimola i sinaptosomi/sinaptonosomi aggiungendo KCl per aumentare k+ extracellulare a 50 mM per 30 s a 37 °C e aggiungere lo stesso volume di buffer Krebs al rispettivo set di controllo non stimolato.
    NOTA: Ad esempio, aggiungere 2,5 μL di 1 M KCl ai sinaptosomi resopensi in 47,5 μL di tampone di Krebs; e aggiungere 2,5 μL di tampone di Krebs al rispettivo sinaptosoma di controllo non stimolato. Per gli esperimenti in cui è coinvolto un gran numero di campioni, procedere con non più di 2 campioni alla volta in modo che il tempo di depolarizzazione non superi i 30 s.
  3. Terminare la stimolazione aggiungendo glutaraldeide (sezione 5).

5. Fissazione e colorazione delle phalloidina dei campioni

  1. Aggiungere la glutaraldeide a campioni omogeneati/sinaptosomici/sinaptosomiali ad una concentrazione finale del 2,5% per 2-3 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Abbiamo aggiunto 6 μL di soluzione di glutaraldeide al 25% in modo che la concentrazione finale di glutaraldeide nei campioni da 50 μL (omogeneati/sinaptosomi/sinaptoneurosmi) fosse di circa il 2,5%. La fissazione è fondamentale e deve essere veloce e quindi immediatamente dopo l'aggiunta di glutaraldeide, il campione deve essere vigorosamente vortexato.
  2. Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.
  3. Rimuovere il supernatante.
    NOTA: Scartare il supernatante in una cappa aspirante poiché la glutaraldeide è tossica.
  4. Permeabilizzare il pellet resopensione in 100 μL di tampone Krebs contenente lo 0,1% di Tritone X-100 e 1 mg/mL NaHB4 per 2-3 min a temperatura ambiente.
  5. Sedimentare i campioni a 20.000 x g per 5 min.
  6. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione.
  7. Lavare il pellet con 200 μL di tampone Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.
  8. Resuspend e macchiare il pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (corrispondente a 500 μU) in 100 μL di tampone Krebs per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
    NOTA: Altre varietà di analoghi fluorescenti della falloidina sono disponibili in commercio e possono essere sostituite per il saggio. La concentrazione di falloidina e il volume totale del campione di incubazione possono essere modificati in base alla quantità e al tipo di tessuto/campione in esame e le condizioni ottimali devono essere standardizzate di conseguenza.
  9. Centrifugare i campioni macchiati a 20.000 x g per 5 minuti.
  10. Rimuovere la phalloidina non vincolata (supernatante).
  11. Lavare il campione con 200 μL di tampone di Krebs per centrifugazione a 20.000 x g per 5 min.
  12. Resuspend in 200 μL di tampone di Krebs contenente 0,32 M di saccarosio.
    NOTA: Il protocollo può essere brevemente messo in pausa qui.

6. Analisi fluorometrica e dispersione della luce

  1. Distribuire campioni macchiati di Phalloidin Alexa Fluor 647 in una piastra nera da 96 po'.
  2. Misurare l'intensità della fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 645 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 670 nm in un lettore di piastre a temperatura ambiente.
  3. Trasferire i campioni dalla piastra nera da 96 pozzi alla piastra trasparente da 96 pozzi utilizzando punte di pipetta da 200 μL.
  4. Misurare lo scattering della luce a 540 nm per correggere eventuali perdite che potrebbero essersi verificate durante i passaggi precedenti di fissazione, permeabilizzazione e colorazione.
    NOTA: Le variazioni del materiale biologico trattenuto nei campioni macchiati potrebbero essere più importanti per piccole quantità di materiale di partenza (vedi Discussione).
  5. Includere un set di Alexa Fluor 647 Phalloidin nel tampone di Krebs a diverse concentrazioni (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x corrispondenti a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) per ogni lotto del saggio come curva standard.
    NOTA: Si tratta di un passaggio facoltativo che non influisce sui risultati del saggio, in particolare quando i livelli di F-actin sono espressi in modo relativo (sezione 7). Il protocollo può essere messo in pausa qui.

7. Analisi dei dati

  1. La quantità di F-actina nei campioni è direttamente proporzionale all'intensità di fluorescenza della phalloidina legata. Espresso in termini assoluti di unità di limite di falloidina calcolate dalla curva lineare dello standard di falloidina taggata.
    NOTA: Ad esempio, vedere le figure 2A-B, 3A, 4A-B e la figura complementare 2.
  2. Livelli di F-actin espresso come frazione dei campioni di controllo.
    NOTA: Ad esempio, vedere figure 5A-B.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linearità del saggio per la valutazione dei livelli di F-actin
In primo luogo, è stata accertata una curva standard per l'aumento lineare della fluorescenza della fluorescenza di Alexa Fluor 647 Phalloidin ed è stata ripetuta per ogni seriedi esperimenti (figura 1). Per studiare la gamma lineare del saggio, sono state elaborate diverse quantità di omogeneati cerebrali provenienti dai roditori(figure 2A e 2B)e dai soggetti umani post mort...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il saggio qui descritto, essenzialmente adattato da unostudio precedente 30 con modifiche, utilizza una phallotoxin, la falloidina contrassegnata con un'etichetta fluorescente. Gli analoghi fluorescenti della falloidina sono considerati il gold standard per la colorazione dei filamenti di actina nei tessutifissi 47,48,49. In effetti, sono gli strumenti più antichi per identificare specificamente i filamen...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro fu supportato dalla Fondazione Neurologica della Nuova Zelanda (1835-PG), dal Consiglio per la Ricerca sanitaria della Nuova Zelanda (#16-597) e dal Dipartimento di Anatomia dell'Università di Otago, Nuova Zelanda. Siamo in debito con la Banca neurologica dei tessuti di HCB-IDIBAPS BioBank (Spagna) per i tessuti cerebrali umani. Ringraziamo Jiaxian Zhang per il suo aiuto nella registrazione e nella modifica del video.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,5 mL, provetta aperta in policarbonato a parete spessaBeckman Coulter349622Per centrifugazione in gradiente (preparazione dei sinaptosomi)
Alexa Fluor 647 FalloidinaThermo Fisher ScientificA22287Ligando specifico per F-actina
Anticorpo contro   b-actinaSanta Cruz BiotechnologySc-47778Per la valutazione dei livelli di actina totale mediante immunoblotting
Anticorpo contro GAPDHAbcamAb181602Per la valutazione dei livelli di GAPDH mediante immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Concentrato di coloranti Bio-Rad5000006Stima delle proteine basata su Bradford
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC3306Componente tampone Krebs
cOmplete, Mini, EDTA-free Cocktail di inibitori della proteasiSigma-Aldrich4693159001Per l'inibizione dell'attività della proteasi endogena durante la preparazione del campione
Corning 96-well Clear Flat Bottom PolystyreneCorning3596Per misure di diffusione della luce
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270Componente tampone Krebs
Dimetil solfossidoSigma-AldrichD5879Solvente per falloidina e latrunculina Scanner
piano fluorescente A (Odyssey Infrared Scanner)Li-Cor BiosciencesPer il rilevamento di segnali immunoreattivi su immunoblot
HEPESSigma-AldrichH3375Ingrediente tampone per la preparazione del campione e componente tampone Krebs
Latrunculina ASigma-AldrichL5163Depolimerizzante di filamenti di actina
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670Componente tampone Krebs
Micropiastre
Filtro a membrana Mitex 5 mmMilliporeLSWP01300Preparazione dei sinaptoneurosomi
Nunc F96 MicroWell Black PlateThermo Fisher Scientific237105Per misure fluorimetriche
Filtro a rete in nylon 100 mmMilliporeNY1H02500Preparazione di sinaptoneurosomi
Cocktail di inibitori della fosfatasi IVAbcamab201115Per l'inibizione dell'attività della fosfatasi endogena durante la preparazione del campione
Cloruro di potassio (KCl)Sigma-AldrichP9541Componente tampone di Krebs e per la depolarizzazione dei terminali sinaptici
Fosfato di potassio monobasico ((KH2PO4 )Sigma-AldrichP9791Componente tampone Krebs
Boroidruro di sodio (NaBH4)Sigma-Aldrich71320Componente del tampone di permeabilizzazione
Cloruro di sodio (NaCl)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Componente tampone Krebs
Carbonato acido di sodio (NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)Componentetampone BSPSL900 Krebs
SpectraMax i3xDispositiviPer misure fluorimetriche
SaccarosioFisher ChemicalS/8600/60Ingrediente tampone per la preparazione del campione
Portafiltro SwimnexMilliporeSx0001300Preparazione di sinaptoneurosomi
Macinatore di tessuti 5 mL Potter-ElvehjemDuran Wheaton Kimble358034Per l'omogeneizzazione dei tessuti
Triton X-100Sigma-AldrichX100Componente del tampone di permeabilizzazione
Base TrizmaSigma-AldrichT6066Ingrediente tampone per la preparazione del campione
Soluzione di glutaraldeide (25% in acqua) Fissativo Sigma-Aldrich G6257 di grado II molecolari

References

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