Un test metrico per valutare la memoria di lavoro spaziale nei ratti adulti a seguito di lesioni cerebrali traumatiche

La prevalenza di deficit neurologici come l'attenzione, la funzione esecutiva e alcuni deficit di memoria dopo una moderata lesione cerebrale traumatica (TBI) è superiore al 50%^{1,2,3,4,5,6,7,8.} Tbi può portare a gravi menomazioni nella memoria spaziale a breve termine, a lungo termine e di lavoro⁹. Queste compromissioni della memoria sono state osservate in modelli di roditori di TBI. I modelli di roditori hanno permesso lo sviluppo di tecniche per testare la memoria, consentendo esami più approfonditi sull'effetto del TBI sull'elaborazione della memoria nei sistemi di memoria neurale.

Due test, relativi rispettivamente all'elaborazione delle informazioni spaziali topologiche e metriche, aiutano a misurare la memoria di lavoro spaziale (SWM). Il test topologico dipende dalla modifica delle dimensioni dello spazio ambientale o degli spazi correlati di connessione o involucro attorno a un oggetto, mentre il test metrico valuta i cambiamenti di angoli o distanza tra gli oggetti^10,11. Goodrich-Hunsaker et al. hanno prima adattato il test topologico umano per i ratti¹⁰ e applicato il compito metrico per dissociare i ruoli della corteccia parietale (PC) e dell'ippocampo dorsale nell'elaborazione delle informazioni spaziali¹¹. Allo stesso modo, Gurkoff e colleghi hanno valutato compiti di memoria metrica, topologica e temporale dopo la lesione da percussione del fluido laterale⁹. Esiste una correlazione tra il danno a determinate regioni del cervello e la compromissione della memoria metrica o topologica. È stato suggerito che la compromissione della memoria metrica è correlata a lesioni nel giro dentato dorsale bilaterale e nella sottoregione del cornu ammonis (CA) CA3 dell'ippocampo e che la compromissione della memoria topologica è correlata alle lesioni bilaterali della corteccia parietale^10,12.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare il deficit di memoria spaziale in una popolazione di ratti tramite un compito metrico. Questo metodo è un'alternativa adatta per studiare i meccanismi di SWM dopo una lesione cerebrale e i suoi vantaggi includono la relativa facilità di implementazione, l'alta sensibilità, il basso costo di riproducibilità, la possibilità di osservazione dinamica e un ambiente a basso stress. Rispetto ad altri compiti comportamentali come il labirinto di Barnes^13,14,il compito di navigazione in acqua Morris^15,16,17o i compiti del labirinto spaziale^18,19,questo test metrico è meno complicato. Grazie alla sua facilità di implementazione, il test metrico richiede un periodo di allenamento più breve e meno stressante e si svolge in soli 2 giorni^9:1 giorno per l'assuefazione e 1 giorno per il compito. Inoltre, il nostro test proposto è più facile da eseguire rispetto ad altri test a basso stress, come il nuovo compito di riconoscimento degli oggetti (NOR) e non richiede il giorno in più di assuefazione²⁰.

Questo documento fornisce un modello semplice per valutare SWM dopo una lesione cerebrale. Questa valutazione del SWM post-TBI può aiutare in un'indagine più completa della sua fisiopatologia.

Gli esperimenti sono stati condotti seguendo le raccomandazioni delle Dichiarazioni di Helsinki e Tokyo e le Linee guida per l'uso degli animali da esperimento della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Una sequenza temporale del protocollo è illustrata nella Figura 1.

1. Procedure chirurgiche e TBI a percussione fluida

1. Alcuni ratti Sprague-Dawley adulti maschi e femmine, alloggiati a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e umidità del 40%-60%, con cicli luce-buio di 12-12 ore.
2. Fornire cibo come chow e acqua ad libitum. Esegui esperimenti tra le ore del mattino, ad es. 6:00 a.m. e 12:00 p.m.
3. Eseguire una valutazione neurologica di base sia per il gruppo di controllo che per il TBI prima dell'inizio dell'esperimento (vedere paragrafo 2 di seguito).
4. Anestetizzare i ratti con isoflurano inalato al 4% per induzione e 1,5% per il mantenimento dell'anestesia. Assicurarsi che il ratto sia immobilizzato testando il riflesso del pedale o il movimento in risposta a un irritante.
   NOTA: utilizzare un sistema di somministrazione continua di isoflurano per l'anestesia. Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.
5. Eseguire lesioni parasagittali fluido-percussioni come precedentemente descritto^21,22.
6. Iniettare per via sottocutanea 0,2 ml di bupivacaina allo 0,5% lungo il sito di incisione prospettica, prima dell'incisione. portare il ratto nella sala di recupero e continuare a monitorare lo stato neurologico (ad esempio, paralisi), respiratorio (ad esempio, arresto respiratorio) e cardiovascolare (ad esempio, diminuzione della perfusione dei tessuti molli, cambiamenti di colore delle pupille e bradicardia) per 24 ore. Prima dell'emergenza dall'anestesia, somministrare 0,01 - 0,05 mg / kg di buprenorfina intramuscolare come analgesia postoperatoria. Ripetere le dosi ogni 6 - 12 ore per almeno 48 ore.

2. Valutazione del punteggio di gravità neurologica (NSS)

NOTA: La valutazione del deficit neurologico è stata eseguita e classificata utilizzando un NSS, come precedentemente descritto^23,24. Il punteggio massimo di alterazione della funzione motoria e del comportamento è di 24 punti. Un punteggio di 0 indica uno stato neurologico intatto e 24 indica una grave disfunzione neurologica, come descritto in precedenza²⁴.

1. Testare l'incapacità del ratto di lasciare un cerchio (50 cm di diametro) quando viene posizionato al centro. Esegui questa attività tre volte, con ogni sessione della durata di 30 minuti, 60 minuti e più di 60 minuti ciascuna.
   NOTA: se raccogli i ratti per la coda, tieni la base della coda.
2. Testare il ratto per una perdita di riflesso raddrizzante.
   1. Metti l'animale sulla schiena nel palmo della mano del ricercatore. Dare un punteggio di 1 se l'animale è in grado di raddrizzarsi²⁵ (in piedi su tutte e quattro le zampe).
3. Testare il ratto per l'emiplegia, l'incapacità del ratto di resistere al posizionamento forzato.
4. Sollevare il ratto per la coda per testare la flessione riflessiva dell'arto posteriore.
5. Metti il topo sul pavimento per testare la sua capacità di camminare dritto.
6. Eseguire test per tre comportamenti riflessivi: il riflesso pinna, il riflesso corneale e il riflesso di startle.
   1. Per il riflesso pinna, eseguire una leggera stimolazione tattile per testare la retrazione dell'orecchio come descritto in precedenza²⁵.
   2. Per testare il riflesso corneale, monitorare la risposta del battito di ciglia quando si applica leggermente un bastoncino morbido all'occhio e misurare su una scala di 0 (nessuna risposta) al battito di ciglia triplo occhio (3), come precedentemente descritto²⁵.
   3. Per il riflesso di startle, trascinare una penna sulla parte superiore della gabbia metallica e registrare la risposta con una scala da 0 (nessuna risposta) a 3 (salto di 1 cm o più), come descritto in precedenza²⁵.
7. Classificare il ratto in base alla perdita del comportamento di ricerca e della prostrazione (non muovere i baffi, annusare o correre dopo essere stato trasferito in un nuovo ambiente)²⁴.
8. Testare i riflessi degli arti per il posizionamento sugli arti anteriori sinistro e destro, quindi sugli arti posteriori sinistro e destro.
9. Analizza la funzionalità tramite l'attività di bilanciamento del fascio con un raggio largo 1,5 cm. Eseguire il test per sessioni della durata di 20 secondi, 40 secondi e più di 60 secondi.
10. Esegui il test di camminata del fascio con tre diverse travi: 8,5 cm di larghezza, 5 cm di larghezza e 2,5 cm di larghezza.

3. Preparazione per l'attività metrica

1. Attrezzatura
   1. Posizionare una piattaforma circolare nera di 200 cm di diametro e 1 cm di spessore su un tavolo. L'altezza del tavolo dovrebbe essere di 80 cm sopra il pavimento.
   2. Stabilisci due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
      NOTA: In questo esperimento, sono state utilizzate due bottiglie di vetro per oggetti, una bottiglia rotonda con un'altezza di 13,5 cm e un'altra bottiglia sfaccettata con un'altezza di 20 cm. Riempire le bottiglie con acqua per garantire la stabilità.
   3. Preparare una fotocamera e installare il software necessario per l'acquisizione, il salvataggio e l'elaborazione dei dati. Installare la telecamera ad un'altezza di 290 cm dal pavimento.
      NOTA: la distanza tra la piattaforma e la fotocamera dipende dalle specifiche della telecamera. La cornice della telecamera deve coprire l'intera area dell'arena in cui viene condotto il test. La distanza per il nostro esperimento tra la piattaforma e la fotocamera era di 210 cm.
2. Assuefazione
   1. Il giorno prima del compito, abituare il topo al nuovo ambiente per 10 minuti posizionandolo nell'arena senza registrazione video.
      NOTA: non eseguire le attività neurologiche e l'attività metrica nello stesso giorno.
      NOTA: eseguire test metrici in un'area a luci rosse.

4. Esecuzione dell'attività metrica

NOTA: l'esecuzione dell'attività metrica consiste in due periodi: 1) assuefazione (15 min) e 2) periodo di test (5 min).

1. Periodo di assuefazione
   1. Stabilire due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
   2. Posiziona il topo all'estremità della piattaforma equidistante dagli oggetti per un periodo di 15 minuti e registra il video.
   3. Rimuovere il topo dalla piattaforma e metterlo in una gabbia individuale per 5 minuti.
   4. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.
      NOTA: fino al 70% di alcol può essere utilizzato per pulire la piattaforma in aree ben ventilate.
2. Periodo di prova
   1. Ridurre la distanza tra gli oggetti a 34 cm.
   2. Posiziona il topo sulla piattaforma per 5 minuti e registra l'attività di esplorazione del ratto in video.
   3. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.

5. Analisi dei dati

NOTA: l'analisi dei dati viene eseguita da un software di tracciamento video appositamente progettato per studi sul comportamento animale che registra automaticamente l'attività e il movimento degli animali (vedere Tabella dei materiali). Questo software automatizza una serie di variabili comportamentali, tra cui mobilità, attività e comportamento esplorativo.

1. Prima di analizzare i file video, inserire la chiave hardware del software. Avviare il software di monitoraggio video e aprire Il modellopreimpostato .
2. Nella sezione Configurazione verificare le impostazioni come segue: Arena, Controllo di provae Rilevamento impostazioni (vedere la Figura 2a).
   NOTA: per questo esperimento, i parametri per l'area di esplorazione sono definiti come 6 cm intorno all'oggetto di interesse. È stato misurato il tempo in cui il ratto è entrato in quest'area.
3. Dopo aver verificato le impostazioni, duplicarle e rinominarle.
4. Nella schermata generale del programma, Grab Background facendo clic con il pulsante destro del mouse.
5. Selezionare un file video per l'immagine di sfondo. Nel menu Sfoglia, selezionare la posizione del file video.
6. Cattura l'immagine e contrassegna le aree e le zone indagate, calibrando l'immagine per l'analisi. Eseguire gli stessi passaggi per Il controllo della versione di prova e il rilevamento delle impostazioni.
7. Nel menu generale, selezionare Elenco prove e scaricare l'elenco dei file video per l'analisi.
8. Aggiungi i video e indica la posizione con le impostazioni richieste.
9. Selezionare acquisizione e Avvia versione di prova (vedere figura 2b,c). Esportare tutti i dati come file Excel (vedere la Figura 2d).
   NOTA: eseguire tutti i calcoli per i periodi di assuefazione e di prova. La valutazione delle attività metriche viene preparata con un modello avanzato.

Il significato dei confronti tra i gruppi è stato determinato utilizzando il test di Mann-Whitney. La significatività statistica dei risultati è stata considerata a P < 0,05, mentre la rilevanza statisticamente elevata è stata misurata a P < 0,01.

I risultati non hanno mostrato differenze nella NSS tra tutti i gruppi prima dell'intervento e 28 giorni dopo il TBI. Ogni gruppo era composto da 12 femmine o 12 ratti maschi. I punteggi NSS ottenuti 48 ore dopo TBI sono presentati nella Tabella 1. I ratti del gruppo TBI che hanno mostrato un deficit neurologico significativo il giorno 28 dopo l'infortunio sono stati esclusi dall'esperimento. I dati vengono misurati come conteggi e presentati come intervallo di ± mediana.

Il gruppo di controllo operato da sham non ha mostrato alcun deficit neurologico a 48 ore dopo il primo giorno dello studio (NSS-0). Il deficit neurologico a 48 ore dopo TBI era significativamente maggiore per i ratti TBI maschi rispetto ai ratti maschi operati da sham (5,5 (4-7) vs. 0(0-0), U = 0, p < 0,01, r = -0,89), e per i ratti tbI femmine rispetto ai ratti femmina con trattamento fittizio (4,5 (3,25-6) vs. 0(0-0), U = 0, p < 0,01, r = -0,91), secondo il test di Mann-Whitney (Tabella 1).

Un test di Mann-Whitney ha indicato che il tempo di esplorazione degli oggetti durante il compito metrico era significativamente più breve per i ratti tbi maschi rispetto ai ratti maschi operati da sham (130% ± 44,3% rispetto al 1978% ± 59,2%), U = 0, p < 0,01, r = -0,85 (vedi Figura 3a,b). I dati sono misurati in secondi espressi in % del punto di riferimento e presentati come media ± SEM. Il valore di riferimento è misurato come il tempo di esplorazione durante i primi 5 minuti del periodo di assuefazione. I restanti tre punti temporali (5-10 min, 10-15 min e 20-25 min) sono stati calcolati come percentuale della linea di base.

Un test di Mann-Whitney ha indicato che il tempo di esplorazione degli oggetti durante il compito metrico era significativamente più breve per le femmine di ratto TBI rispetto alle femmine di ratto operato fittizio (89% ± 43,5% vs. 2160% ± 43,6%), U = 0, p < 0,01, r = -0,85 (vedi Figura 4a,b). I dati sono misurati in secondi espressi in % del punto di riferimento e presentati come media ± SEM. Il basale è misurato come il tempo di esplorazione durante il periodo di assuefazione.

Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra gruppi maschili e femminili.

Figura 1: Schema di protocollo con tempistiche. Questa figura mostra la sequenza temporale del protocollo. Gruppi di ratti in momenti diversi includevano un gruppo di controllo operato in modo fittizio e un gruppo TBI e sono stati valutati in base al punteggio NSS a -1 h, 48 h e 28 giorni dopo l'infortunio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi dei dati rappresentativi. Cattura dello schermo del software di monitoraggio video per (A) Impostazioni di controllo di prova (B) Elenco di prova e (C) Acquisizione e dati di esempio esportati in Excel (D). Vedi testo e video per i dettagli. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Compito metrico per ratti maschi. Il tempo di esplorazione degli oggetti durante il compito metrico è stato significativamente più breve per i ratti TBI maschi rispetto ai ratti maschi operati da sham (vedi Figura 3a,b, che illustra i dati su diverse scale dell'asse y). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Attività metrica per ratti femmina. Il tempo di esplorazione degli oggetti durante il compito metrico è stato significativamente più breve per le femmine di ratto TBI rispetto alle femmine di ratto sham-operated (vedi Figura 4a,b, che illustra i dati su diverse scale dell'asse y). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Determinazione delle prestazioni neurologiche. Il deficit neurologico a 48 ore dopo tbi è stato significativamente maggiore per i ratti TBI maschi rispetto ai ratti maschi operati da sham e ai ratti tbi femmine rispetto ai ratti femmina operati da sham.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.