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Articolo metodologico

Un test metrico per valutare la memoria di lavoro spaziale nei ratti adulti a seguito di lesioni cerebrali traumatiche

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DOI:

10.3791/62291

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7 maggio 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka Medical Center, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 3Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 4Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology and Medicine, Dnepropetrovsk State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è comunemente associata a compromissione della memoria. Qui, presentiamo un protocollo per valutare la memoria di lavoro spaziale dopo TBI tramite un'attività metrica. Un test metrico è uno strumento utile per studiare la compromissione della memoria di lavoro spaziale dopo TBI.

Abstract

Le menomazioni alla memoria sensoriale, a breve termine e a lungo termine sono effetti collaterali comuni dopo lesioni cerebrali traumatiche (TBI). A causa dei limiti etici degli studi sull'uomo, i modelli animali forniscono alternative adeguate ai metodi di trattamento dei test e per studiare i meccanismi e le relative complicanze della condizione. I modelli sperimentali di roditori sono stati storicamente i più utilizzati grazie alla loro accessibilità, basso costo, riproducibilità e approcci convalidati. Un test metrico, che verifica la capacità di richiamare il posizionamento di due oggetti a varie distanze e angoli l'uno dall'altro, è una tecnica per studiare la compromissione della memoria di lavoro spaziale (SWM) dopo TBI. I vantaggi significativi delle attività metriche includono la possibilità di osservazione dinamica, basso costo, riproducibilità, relativa facilità di implementazione e ambiente a basso stress. Qui, presentiamo un protocollo di test metrico per misurare la compromissione di SWM nei ratti adulti dopo TBI. Questo test fornisce un modo fattibile per valutare la fisiologia e la fisiopatologia della funzione cerebrale in modo più efficace.

Introduzione

La prevalenza di deficit neurologici come l'attenzione, la funzione esecutiva e alcuni deficit di memoria dopo una moderata lesione cerebrale traumatica (TBI) è superiore al 50%1,2,3,4,5,6,7,8. Tbi può portare a gravi menomazioni nella memoria spaziale a breve termine, a lungo termine e di lavoro9. Queste compromissioni della memoria sono state osservate in modelli di roditori di TBI. I modelli di roditori hanno permesso lo sviluppo di tecniche per testare la memoria, consentendo esami più approfonditi sull'effetto del TBI sull'elaborazione della memoria nei sistemi di memoria neurale.

Due test, relativi rispettivamente all'elaborazione delle informazioni spaziali topologiche e metriche, aiutano a misurare la memoria di lavoro spaziale (SWM). Il test topologico dipende dalla modifica delle dimensioni dello spazio ambientale o degli spazi correlati di connessione o involucro attorno a un oggetto, mentre il test metrico valuta i cambiamenti di angoli o distanza tra gli oggetti10,11. Goodrich-Hunsaker et al. hanno prima adattato il test topologico umano per i ratti10 e applicato il compito metrico per dissociare i ruoli della corteccia parietale (PC) e dell'ippocampo dorsale nell'elaborazione delle informazioni spaziali11. Allo stesso modo, Gurkoff e colleghi hanno valutato compiti di memoria metrica, topologica e temporale dopo la lesione da percussione del fluido laterale9. Esiste una correlazione tra il danno a determinate regioni del cervello e la compromissione della memoria metrica o topologica. È stato suggerito che la compromissione della memoria metrica è correlata a lesioni nel giro dentato dorsale bilaterale e nella sottoregione del cornu ammonis (CA) CA3 dell'ippocampo e che la compromissione della memoria topologica è correlata alle lesioni bilaterali della corteccia parietale10,12.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare il deficit di memoria spaziale in una popolazione di ratti tramite un compito metrico. Questo metodo è un'alternativa adatta per studiare i meccanismi di SWM dopo una lesione cerebrale e i suoi vantaggi includono la relativa facilità di implementazione, l'alta sensibilità, il basso costo di riproducibilità, la possibilità di osservazione dinamica e un ambiente a basso stress. Rispetto ad altri compiti comportamentali come il labirinto di Barnes13,14,il compito di navigazione in acqua Morris15,16,17o i compiti del labirinto spaziale18,19,questo test metrico è meno complicato. Grazie alla sua facilità di implementazione, il test metrico richiede un periodo di allenamento più breve e meno stressante e si svolge in soli 2 giorni9:1 giorno per l'assuefazione e 1 giorno per il compito. Inoltre, il nostro test proposto è più facile da eseguire rispetto ad altri test a basso stress, come il nuovo compito di riconoscimento degli oggetti (NOR) e non richiede il giorno in più di assuefazione20.

Questo documento fornisce un modello semplice per valutare SWM dopo una lesione cerebrale. Questa valutazione del SWM post-TBI può aiutare in un'indagine più completa della sua fisiopatologia.

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Protocollo

Gli esperimenti sono stati condotti seguendo le raccomandazioni delle Dichiarazioni di Helsinki e Tokyo e le Linee guida per l'uso degli animali da esperimento della Comunità europea. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Una sequenza temporale del protocollo è illustrata nella Figura 1.

1. Procedure chirurgiche e TBI a percussione fluida

  1. Alcuni ratti Sprague-Dawley adulti maschi e femmine, alloggiati a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e umidità del 40%-60%, con cicli luce-buio di 12-12 ore.
  2. Fornire cibo come chow e acqua ad libitum. Esegui esperimenti tra le ore del mattino, ad es. 6:00 a.m. e 12:00 p.m.
  3. Eseguire una valutazione neurologica di base sia per il gruppo di controllo che per il TBI prima dell'inizio dell'esperimento (vedere paragrafo 2 di seguito).
  4. Anestetizzare i ratti con isoflurano inalato al 4% per induzione e 1,5% per il mantenimento dell'anestesia. Assicurarsi che il ratto sia immobilizzato testando il riflesso del pedale o il movimento in risposta a un irritante.
    NOTA: utilizzare un sistema di somministrazione continua di isoflurano per l'anestesia. Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche.
  5. Eseguire lesioni parasagittali fluido-percussioni come precedentemente descritto21,22.
  6. Iniettare per via sottocutanea 0,2 ml di bupivacaina allo 0,5% lungo il sito di incisione prospettica, prima dell'incisione. portare il ratto nella sala di recupero e continuare a monitorare lo stato neurologico (ad esempio, paralisi), respiratorio (ad esempio, arresto respiratorio) e cardiovascolare (ad esempio, diminuzione della perfusione dei tessuti molli, cambiamenti di colore delle pupille e bradicardia) per 24 ore. Prima dell'emergenza dall'anestesia, somministrare 0,01 - 0,05 mg / kg di buprenorfina intramuscolare come analgesia postoperatoria. Ripetere le dosi ogni 6 - 12 ore per almeno 48 ore.

2. Valutazione del punteggio di gravità neurologica (NSS)

NOTA: La valutazione del deficit neurologico è stata eseguita e classificata utilizzando un NSS, come precedentemente descritto23,24. Il punteggio massimo di alterazione della funzione motoria e del comportamento è di 24 punti. Un punteggio di 0 indica uno stato neurologico intatto e 24 indica una grave disfunzione neurologica, come descritto in precedenza24.

  1. Testare l'incapacità del ratto di lasciare un cerchio (50 cm di diametro) quando viene posizionato al centro. Esegui questa attività tre volte, con ogni sessione della durata di 30 minuti, 60 minuti e più di 60 minuti ciascuna.
    NOTA: se raccogli i ratti per la coda, tieni la base della coda.
  2. Testare il ratto per una perdita di riflesso raddrizzante.
    1. Metti l'animale sulla schiena nel palmo della mano del ricercatore. Dare un punteggio di 1 se l'animale è in grado di raddrizzarsi25 (in piedi su tutte e quattro le zampe).
  3. Testare il ratto per l'emiplegia, l'incapacità del ratto di resistere al posizionamento forzato.
  4. Sollevare il ratto per la coda per testare la flessione riflessiva dell'arto posteriore.
  5. Metti il topo sul pavimento per testare la sua capacità di camminare dritto.
  6. Eseguire test per tre comportamenti riflessivi: il riflesso pinna, il riflesso corneale e il riflesso di startle.
    1. Per il riflesso pinna, eseguire una leggera stimolazione tattile per testare la retrazione dell'orecchio come descritto in precedenza25.
    2. Per testare il riflesso corneale, monitorare la risposta del battito di ciglia quando si applica leggermente un bastoncino morbido all'occhio e misurare su una scala di 0 (nessuna risposta) al battito di ciglia triplo occhio (3), come precedentemente descritto25.
    3. Per il riflesso di startle, trascinare una penna sulla parte superiore della gabbia metallica e registrare la risposta con una scala da 0 (nessuna risposta) a 3 (salto di 1 cm o più), come descritto in precedenza25.
  7. Classificare il ratto in base alla perdita del comportamento di ricerca e della prostrazione (non muovere i baffi, annusare o correre dopo essere stato trasferito in un nuovo ambiente)24.
  8. Testare i riflessi degli arti per il posizionamento sugli arti anteriori sinistro e destro, quindi sugli arti posteriori sinistro e destro.
  9. Analizza la funzionalità tramite l'attività di bilanciamento del fascio con un raggio largo 1,5 cm. Eseguire il test per sessioni della durata di 20 secondi, 40 secondi e più di 60 secondi.
  10. Esegui il test di camminata del fascio con tre diverse travi: 8,5 cm di larghezza, 5 cm di larghezza e 2,5 cm di larghezza.

3. Preparazione per l'attività metrica

  1. Attrezzatura
    1. Posizionare una piattaforma circolare nera di 200 cm di diametro e 1 cm di spessore su un tavolo. L'altezza del tavolo dovrebbe essere di 80 cm sopra il pavimento.
    2. Stabilisci due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
      NOTA: In questo esperimento, sono state utilizzate due bottiglie di vetro per oggetti, una bottiglia rotonda con un'altezza di 13,5 cm e un'altra bottiglia sfaccettata con un'altezza di 20 cm. Riempire le bottiglie con acqua per garantire la stabilità.
    3. Preparare una fotocamera e installare il software necessario per l'acquisizione, il salvataggio e l'elaborazione dei dati. Installare la telecamera ad un'altezza di 290 cm dal pavimento.
      NOTA: la distanza tra la piattaforma e la fotocamera dipende dalle specifiche della telecamera. La cornice della telecamera deve coprire l'intera area dell'arena in cui viene condotto il test. La distanza per il nostro esperimento tra la piattaforma e la fotocamera era di 210 cm.
  2. Assuefazione
    1. Il giorno prima del compito, abituare il topo al nuovo ambiente per 10 minuti posizionandolo nell'arena senza registrazione video.
      NOTA: non eseguire le attività neurologiche e l'attività metrica nello stesso giorno.
      NOTA: eseguire test metrici in un'area a luci rosse.

4. Esecuzione dell'attività metrica

NOTA: l'esecuzione dell'attività metrica consiste in due periodi: 1) assuefazione (15 min) e 2) periodo di test (5 min).

  1. Periodo di assuefazione
    1. Stabilire due oggetti diversi al centro della piattaforma circolare a 68 cm di distanza l'uno dall'altro.
    2. Posiziona il topo all'estremità della piattaforma equidistante dagli oggetti per un periodo di 15 minuti e registra il video.
    3. Rimuovere il topo dalla piattaforma e metterlo in una gabbia individuale per 5 minuti.
    4. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.
      NOTA: fino al 70% di alcol può essere utilizzato per pulire la piattaforma in aree ben ventilate.
  2. Periodo di prova
    1. Ridurre la distanza tra gli oggetti a 34 cm.
    2. Posiziona il topo sulla piattaforma per 5 minuti e registra l'attività di esplorazione del ratto in video.
    3. Pulire la piattaforma con il 5% -10% di alcol.

5. Analisi dei dati

NOTA: l'analisi dei dati viene eseguita da un software di tracciamento video appositamente progettato per studi sul comportamento animale che registra automaticamente l'attività e il movimento degli animali (vedere Tabella dei materiali). Questo software automatizza una serie di variabili comportamentali, tra cui mobilità, attività e comportamento esplorativo.

  1. Prima di analizzare i file video, inserire la chiave hardware del software. Avviare il software di monitoraggio video e aprire Il modellopreimpostato .
  2. Nella sezione Configurazione verificare le impostazioni come segue: Arena, Controllo di provae Rilevamento impostazioni (vedere la Figura 2a).
    NOTA: per questo esperimento, i parametri per l'area di esplorazione sono definiti come 6 cm intorno all'oggetto di interesse. È stato misurato il tempo in cui il ratto è entrato in quest'area.
  3. Dopo aver verificato le impostazioni, duplicarle e rinominarle.
  4. Nella schermata generale del programma, Grab Background facendo clic con il pulsante destro del mouse.
  5. Selezionare un file video per l'immagine di sfondo. Nel menu Sfoglia, selezionare la posizione del file video.
  6. Cattura l'immagine e contrassegna le aree e le zone indagate, calibrando l'immagine per l'analisi. Eseguire gli stessi passaggi per Il controllo della versione di prova e il rilevamento delle impostazioni.
  7. Nel menu generale, selezionare Elenco prove e scaricare l'elenco dei file video per l'analisi.
  8. Aggiungi i video e indica la posizione con le impostazioni richieste.
  9. Selezionare acquisizione e Avvia versione di prova (vedere figura 2b,c). Esportare tutti i dati come file Excel (vedere la Figura 2d).
    NOTA: eseguire tutti i calcoli per i periodi di assuefazione e di prova. La valutazione delle attività metriche viene preparata con un modello avanzato.

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Risultati

Il significato dei confronti tra i gruppi è stato determinato utilizzando il test di Mann-Whitney. La significatività statistica dei risultati è stata considerata a P < 0,05, mentre la rilevanza statisticamente elevata è stata misurata a P < 0,01.

I risultati non hanno mostrato differenze nella NSS tra tutti i gruppi prima dell'intervento e 28 giorni dopo il TBI. Ogni gruppo era composto da 12 femmine o 12 ratti maschi. I punteggi NSS ottenuti 48 ore dopo TBI sono presentati nella

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Discussione

Prendendo di mira in modo specifico il processo di informazione spaziale metrica, questo test metrico fornisce uno strumento necessario per comprendere la carenza di memoria dopo TBI. Il protocollo presentato in questo documento è una modifica delle attività comportamentali precedentemente descritte11. Un'attività metrica descritta in precedenza utilizzava due diversi paradigmi, ciascuno costituito da tre sessioni di assuefazione e una sessione di test. Il primo paradigma consisteva nello spostare...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la professoressa Olena Severynovska; Maryna Kuscheriava M.Sc; Maksym Kryvonosov M.Sc; Daryna Yakumenko M.Sc; Evgenia Goncharyk M.Sc; e Olha Shapoval, dottoranda presso il Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Biologia, Ecologia e Medicina, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ucraina per i loro contributi di supporto e utili. I dati sono stati ottenuti come parte della tesi di dottorato di Dmitry Frank.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clorexidina al 2% in soluzione alcolica al 70%SIGMA - ALDRICH500 ccPer l'antisepsi generale della pelle in campo operatorio
  Bupivacaina 0,1 %
4 pannelli di diversi spessori (1,5 cm, 2,5 cm, 5 cm e 8,5 cm)Questo serve a valutare il difetto
4-0 Sutura in nylon4-00
FlaconiTechniplastACBT0262SUflaconi da 150 ml riempiti con 100 ml di acqua e 100 ml di soluzione di saccarosio all'1% (p/v)
Bottlses (quattro) per compiti topologici e metriciPer gli oggetti utilizzati due bottigliette, la prima di forma tonda (altezza 13,5 cm) e la seconda sfaccettata (altezza 20 cm) e due bottiglie grandi sfaccettate, la prima 9x6 cm (altezza 21 cm) e la seconda 7x7 cm (altezza 21 cm).
Trapano per sega a tazza diamantatoKit sega a tazza in vetroopzionale.
Bilancia digitaleSIGMA - ALDRICHRs 4.000
Forbici da dissezioneSIGMA - ALDRICHZ265969
Etanolo 99,9 %  Farmacia5% -10% soluzione utilizzata per pulire le apparecchiature e rimuovere gli odori
EthoVision XT (software video)Noldus, Wageningen, Paesi BassiDispositivo opzionale
percussione di fluidirealizzato su misura presso l'officinauniversitaria    Non è consigliata alcuna marca specifica.
Spugne di garzaFisher22-362-178
Guanti (guanti da laboratorio sottili)Opzionale.
Riscaldatore con termometroHeatingpad-1Modello: HEATINGPAD-1/2    Non è consigliata alcuna marca specifica.
Horizon-XLMennen Medical Ltd
Isofluran, USP 100%Piramamal Critical Care, IncNDC 66794-017Liquido anestetico per inalazione
Office 365 ProPlusMicrosoft-MicrosoftOffice Excel
Microscopio Olympus BX 40Olympus
Pinza operatoriaSIGMA - ALDRICH
In funzione  ForbiciSIGMA - ALDRICH
PC Computer per la registrazione USV e l'analisi dei datiIntelIntel® core i5-6500 CPU @ 3,2 GHz, 16 GB di RAM, sistema operativo a 64 bit
Scatole in plexiglass collegate da uno stretto passaggioDue scatole in plexiglass trasparenti da 30 cm & volte; 20 cm & volte 20 cm collegate da uno stretto passaggio di 15 cm & volte 15 cm & volte 60 cm
Purina ChowPurina5001Cibo da laboratorio per roditori somministrato a ratti, topi e criceti è un alimento per il ciclo di vita che è stato utilizzato nella ricerca biomedica per oltre 5
gabbie per topi. (ratti, casa, gabbia o altro recinto)Techniplast2000PNon si consiglia alcuna marca specifica
Lame per bisturi 11SIGMA - ALDRICHS2771
SPSSSPSS Inc., Chicago, IL, USA  20 confezioni
Strumento Stereotassicorealizzato su misura presso l'officinauniversitaria    Non è consigliata alcuna marca specifica
Dispositivo di cronometraggioTimer a intervalli: temporizzazione per la registrazione diopzionale. Qualsiasi timer andrà bene, anche se è conveniente utilizzare un timer a intervalli se si sta solleticando più ratti Dispositivo
per attività topologiche e metricheAutoprodotto a Ben Gurion Università del NegevPiattaforma circolare bianca di 200 cm di diametro e 1 cm di spessore sul tavolo
VideocameraLogitechC920 HD PRO WEBCAMVideocamera digitale per la registrazione ad alta definizione del comportamento dei ratti in più test del labirinto
Windows 10Valentina
neurologico da 3 mm di diametro a USV

Riferimenti

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