Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Raphael Nyaruaba; Xiaohong Li; Caroline Mwaliko; Changchang Li; Matilu Mwau; Nelson Odiwour; Elishiba Muturi; Caroline Muema; Junhua Li; Junping Yu; Hongping Wei

doi:10.3791/62295

Articolo metodologico

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

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DOI:

10.3791/62295

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31 marzo 2021

Raphael Nyaruaba¹^,²^,³ , Xiaohong Li¹ , Caroline Mwaliko²^,³^,⁴ , Changchang Li¹ , Matilu Mwau⁵ , Nelson Odiwour¹^,²^,³ , Elishiba Muturi¹^,²^,³ , Caroline Muema¹^,²^,³ , Junhua Li¹ , Junping Yu¹ , Hongping Wei¹

¹Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, ²International College, University of Chinese Academy of Sciences, ³Sino-Africa Joint Research Center, ⁴CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, ⁵Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro riassume i passaggi nello sviluppo di diversi saggi per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. I passaggi sono elaborati e sono state incluse note su come migliorare i test e le prestazioni dell'esperimento. Questi test possono essere utilizzati per molteplici applicazioni SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Abstract

La diagnosi della pandemia di SARS-CoV-2 in corso è una priorità per tutti i paesi del mondo. Attualmente, la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) è il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2 in quanto non è disponibile una soluzione permanente. Per quanto efficace possa essere questa tecnica, la ricerca è emersa mostrando i suoi limiti nel rilevamento e nella diagnosi, specialmente quando si tratta di obiettivi a bassa abbondanza. Al contrario, la PCR digitale a goccia (ddPCR), una recente tecnologia emergente con vantaggi superiori rispetto alla qPCR, ha dimostrato di superare le sfide della RT-qPCR nella diagnosi di SARS-CoV-2 da campioni bersaglio a bassa abbondanza. In prospettiva, in questo articolo, le capacità di RT-ddPCR sono ulteriormente ampliate mostrando i passaggi su come sviluppare saggi simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. Utilizzando primer e sonde mirati a siti specifici del genoma di SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), lo sviluppo di questi saggi si è dimostrato possibile. Inoltre, vengono forniti protocolli dettagliati, note e suggerimenti passo dopo passo su come migliorare il flusso di lavoro dei saggi e analizzare i dati. L'adattamento di questo flusso di lavoro nei lavori futuri garantirà che il numero massimo di obiettivi possa essere rilevato in modo sensibile in un piccolo campione, migliorando significativamente i costi e la produttività del campione.

Introduzione

La reazione a catena della polimerasi (PCR), una tecnica ben riconosciuta, ha subito diverse trasformazioni dal suo avvento per diventare una tecnica potente in grado di fornire risposte alla ricerca sugli acidi nucleici. Queste trasformazioni sono state un costante miglioramento della vecchia tecnica. Queste trasformazioni possono essere riassunte in tre generazioni¹. La prima generazione è la PCR convenzionale che si basa sull'elettroforesi su gel per quantificare e rilevare bersagli amplificati. La seconda generazione è la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) in grado di rilevare campioni in tempo reale e fare affidamento su una curva stan....