Visualizzazione della morfogenesi oculare mediante microscopia Lightsheet utilizzando rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Summary

Qui, viene fornito un protocollo per l'imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l'anestesia embrionale, l'incorporamento nell'agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l'impostazione dei parametri di imaging e infine l'analisi dei dati di imaging utilizzando un software di analisi delle immagini.

Abstract

Lo sviluppo dell'occhio dei vertebrati è un processo complesso che inizia verso la fine della gastrulazione embrionale e richiede il coordinamento preciso della migrazione, proliferazione e differenziazione cellulare. L'immaginazione time-lapse offre una visione unica del comportamento delle cellule durante lo sviluppo dell'occhio perché ci consente di visualizzare l'oculogenesi in vivo. I pesci zebra sono un modello eccellente per visualizzare questo processo grazie al loro occhio vertebrato altamente conservato e alla loro capacità di svilupparsi rapidamente ed esternamente pur rimanendo otticamente trasparenti. Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo dell'occhio di zebrafish sono notevolmente facilitati dall'uso della linea transgenica di zebrafish Tg (rx3: GFP). Nel proencefalo in via di sviluppo, l'espressione rx3: GFP segna le cellule del singolo campo oculare e la GFP continua ad essere espressa mentre il campo oculare evagina per formare una vescicola ottica, che poi si invagina per formare una coppa ottica. L'imaging time lapse ad alta risoluzione dell'espressione rx3: GFP, quindi, ci consente di tracciare l'occhio primordium nel tempo mentre si sviluppa nella retina. La microscopia Lightsheet è un metodo ideale per visualizzare la morfogenesi oculare nel tempo grazie alla sua capacità di penetrare campioni più spessi per l'imaging fluorescente, ridurre al minimo il fotosbiancamento e la fototossicità e l'immagine ad alta velocità. Qui, viene fornito un protocollo per l'imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l'anestesia embrionale, l'incorporamento nell'agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l'impostazione dei parametri di imaging e infine l'analisi dei dati di imaging utilizzando un software di analisi delle immagini. Il set di dati risultante può fornire preziose informazioni sul processo di morfogenesi oculare, nonché perturbazioni a questo processo a seguito di mutazioni genetiche, esposizione ad agenti farmacologici o altre manipolazioni sperimentali.

Introduction

Lo sviluppo embrionale è un processo complesso che richiede il coordinamento preciso di molti eventi diversi. La formazione dell'occhio vertebrato inizia nel proencefalo in via di sviluppo, dove una parte delle cellule è specificata come campo oculare. Queste cellule evaginano verso l'ectoderma superficiale, dando origine a due vescicole ottiche bilaterali 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Il contatto con l'ectoderma superficiale induce quindi un'invaginazione della vescicola ottica in una tazza ottica. L'ectoderma superficiale darà origine alle strutture anteriori dell'occhio, come la lente e la cornea, mentre la coppa ottica darà origine alla retina neurale e all'epitelio pigmentato retinico 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Le interruzioni in questo processo possono portare a difetti congeniti come microftalmia, anoftalmia e coloboma (MAC). Al momento, non ci sono opzioni per correggere questi difetti 3,5,6,7,9,10,11,12. Ulteriori studi sui meccanismi della morfogenesi oculare e sui problemi che possono portare alla MAC forniranno una base di conoscenza che potenzialmente porterà a trattamenti. Un potente strumento per indagare i comportamenti dinamici delle cellule durante lo sviluppo degli occhi è l'immaginazione time-lapse, che consente di visualizzare e caratterizzare questo processo in vivo e in tempo reale.

I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per visualizzare lo sviluppo oculare precoce utilizzando l'imaging time-lapse. Hanno un occhio vertebrato altamente conservato e possiedono la capacità di svilupparsi rapidamente ed esternamente pur rimanendo otticamente trasparenti¹. I pesci zebra forniscono una grande risorsa per l'imaging time-lapse a causa di queste caratteristiche che mancano ai modelli di mammiferi. Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo dell'occhio di zebrafish sono notevolmente facilitati dall'uso della linea transgenica di zebrafish Tg(rx3:GFP)¹³. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) è un fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dell'occhio¹⁴. Rx3 è il primo dei tre geni rx nel pesce zebra ad essere espresso, iniziando la sua espressione a metà gastrulazione, circa 8 ore dopo la fecondazione (hpf)^15,16. Il transgene rx3:GFP può essere visualizzato nel proencefalo in via di sviluppo a partire dallo stadio 1 somite (ss), circa 10 hpf 15,17,18,19,20. Nel proencefalo in via di sviluppo, l'espressione rx3:GFP segna le cellule del singolo campo oculare e la GFP (proteina fluorescente verde) continua ad essere espressa attraverso il resto della morfogenesi oculare. L'imaging time lapse ad alta risoluzione dell'espressione rx3:GFP, quindi, ci consente di tracciare il singolo campo oculare nel tempo mentre si sviluppa nella retina 17,18,20.

Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo del pesce zebra sono stati eseguiti principalmente utilizzando la microscopia confocale o Lightsheet. La microscopia confocale è vantaggiosa in quanto consente l'imaging preciso dei campioni lungo l'asse z e riduce il segnale di fondo fluorescente. Tuttavia, è limitato dalla quantità di tempo necessaria per acquisire un'immagine, dalla rigidità della posizione del campione e dalla sua propensione verso il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni vivi. La microscopia Lightsheet è un metodo ideale per visualizzare la morfogenesi oculare nel tempo grazie alla sua capacità di penetrare campioni più spessi per l'imaging fluorescente, una maggiore flessibilità nell'orientamento del campione, fotosbiancamento e fototossicità ridotti al minimo e l'imaging ad alta velocità ^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31}. La risoluzione spaziale ottenibile con gli attuali sistemi di microscopia a foglio luminoso è di circa 250-500 nanometri (nm). Sebbene questo non sia significativamente diverso da quello che si può ottenere con la microscopia confocale, il campione può essere ruotato liberamente e ripreso da più angolazioni, migliorando sia la profondità che la risoluzione dell'immagine e offrendo una flessibilità molto maggiore per gli esperimenti di imaging time lapse in vivo rispetto alla piattaforma confocale^27,32 . Per questi motivi, la microscopia Lightsheet sta rapidamente diventando il metodo preferito per gli studi di imaging time-lapse dello sviluppo del pesce zebra. Questo protocollo descrive le fasi di quantificazione dell'oculogenesi attraverso l'imaging del pesce zebra transgenico Rx3:GFP utilizzando un microscopio Lightsheet³³ disponibile in commercio e descrive in dettaglio una pipeline per l'analisi delle immagini utilizzando la piattaforma software arivis.

Protocol

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di zebrafish sono stati condotti in conformità con i protocolli stabiliti dall'Università del Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Preparazione del campione

1. Imposta una coppia di accoppiamento di pesci zebra Tg (Rx3: GFP) in un serbatoio incrociato recintato la notte prima che sia pianificata l'imaging. La mattina seguente tira il cancello mentre le luci si accendono nell'impianto di pesca^34,35.
   NOTA: La coppia di pesci selezionati deve avere un'età compresa tra 4 mesi e 2 anni e si distingue facilmente come maschio o femmina in base alla forma del corpo e alla colorazione³⁵.
2. Controlla le croci ogni mezz'ora per gli embrioni e nota a che ora gli embrioni vengono visualizzati per la prima volta sul fondo del serbatoio trasversale. Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri e mantenere gli embrioni a 28,5 °C per circa 10 ore per svilupparsi allo stadio 1-2 somite (ss). Inizia a immaginare allo stadio somite 1-2 (ss).
3. Per lo screening della presenza di somiti, osservare gli embrioni sotto uno stereoscopio a 10 hpf e contare il numero di somiti¹.
   NOTA: Tutti gli embrioni che si trovano oltre il singolo stadio somite non devono essere utilizzati per questo esperimento.
4. Fuori dagli embrioni che si trovano al singolo stadio di somite, lo screening per l'espressione GFP utilizzando un adattatore di fluorescenza in combinazione con uno stereomicroscopio per confermare la presenza del transgene Rx3: GFP. Una volta identificati 3-5 individui positivi alla GFP, utilizzare una pinza fine per decoerniare gli embrioni e trasferirli in una piccola capsula di Petri contenente un tampone embrionale E3 con una pipetta di vetro³⁵.
5. Anestetizzare gli embrioni trasferendoli in un tampone embrionale E3 da 0,5 ml (pH 7) contenente 0,168 mg/mL di tricaina (MS222) in un tubo microcentrifuga^35,36. I movimenti muscolari spontanei iniziano già a 17 hpf³⁷. Assicurarsi che gli embrioni siano anestetizzati per l'immagine oltre questo punto temporale.
6. Incorporare gli embrioni in agarosio a bassa temperatura di fusione all'1% in 0,168 mg / mL di tricaina ed E3.
   NOTA: Questa è la concentrazione ottimale di agarosio a bassa temperatura di fusione per consentire all'embrione di essere tenuto in posizione, ma rimanere abbastanza flessibile da consentire la crescita dell'embrione nel corso del tempo di imaging^30,31.
7. Preparare una soluzione da 10 ml di agarosio a bassa temperatura di fusione al 2% in tampone E3. Riscaldarlo in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio usando intervalli di 15 s, per evitare che la soluzione bolle. Lasciare raffreddare la soluzione abbastanza da tenere senza disagio, ma non così tanto da solidificarsi e non causare danni agli embrioni. Una volta che l'agarosio è sufficientemente freddo, aggiungere 0,5 ml agli embrioni nel tubo di Tricaina in E3 e pipettare delicatamente la soluzione e gli embrioni da miscelare.
8. Utilizzando un capillare di vetro da 1 mm e uno stantuffo in politetrafluoroetilene (PTFE), tirare su gli embrioni nella soluzione di agarosio nel capillare. Assicurati di tirare un totale di 3-5 embrioni (embrioni multipli) nel capillare per aumentare la probabilità di avere un embrione ben posizionato.
   NOTA: A causa della natura rotonda degli embrioni in questo momento, è difficile garantire un orientamento specifico nel capillare. Idealmente, il corpo dell'embrione sarà posizionato lateralmente nel capillare, consentendo la massima facilità di posizionamento all'interno del microscopio.
9. Lasciare che l'agarosio si solidifichi per un periodo di 30-60 s a temperatura ambiente. Posizionare il capillare in un becher di 0,168 mg/ml di tricaina nel tampone E3 fino al momento dell'immagine (Figura 1A).
   NOTA: L'eccesso di soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione al 2% può essere lasciata solidificare e successivamente riscaldata in esperimenti futuri.
10. Posizionare il capillare nel portacampioni (Figura 1B-F) come descritto al punto 2.5.

2. Configurazione di Zeiss Lightsheet Z.1

1. Accendere ogni componente del microscopio e del computer nel seguente ordine: 1) Sistema, 2) PC, quindi 3) Incubazione (Figura 2A).
2. Posizionare l'obiettivo di imaging 20x e l'obiettivo di illuminazione 10x nella camera del microscopio. Corrispondenza con le impostazioni dell'obiettivo nell'interfaccia del software Zen nella scheda Manutenzione .
3. Far scorrere la camera (Figura 2C) nell'alloggiamento sul binario (Figura 2B) con il tubo rivolto verso l'esterno. Il tubo si collega alle porte appropriate a destra, come mostrato nella Figura 2E.
4. Collegare la linea di estensione alla siringa con il meccanismo luer-lock (Figura 2D); riempirlo con Tricaina in E3 e posizionarlo nel supporto attaccato a destra del microscopio³⁵. Collegare l'estensione collegata alla siringa riempita con Tricaina in E3 in basso a destra della camera con il meccanismo luer-lock. Spingere lo stantuffo per riempire la camera con il tampone Tricaine/E3. Chiudi la porta della camera.
5. Posizionare il capillare con il campione nel portacampioni capillare. Il portacampioni capillare comprende due manicotti di gomma, un disco portacampioni in metallo, uno stelo metallico e un cappuccio metallico (Figura 1B). Fare clic sulla guaina metallica al centro del disco metallico (Figura 1C). Posizionare i due tappi di gomma nella guaina, con le fessure rivolte verso le estremità della guaina seguite dal capillare. Far scorrere il capillare attraverso il centro dei tappi di gomma. Fissarlo in posizione con il cappuccio metallico una volta che il marcatore si trova alla base della guaina metallica (Figura 1D).
6. Posizionare il supporto del campione capillare sulla parte superiore del microscopio, con i segni bianchi allineati (Figura 1E, F). Chiudere il coperchio.
7. Fare clic sul pulsante Individua capillare sull'interfaccia del software (Figura 3A). Utilizzare il pannello di controllo ErgoDrive, un dispositivo manuale che controlla l'orientamento capillare (Figura 3E), per spostare il capillare e posizionarlo appena sopra l'obiettivo (Figura 3B).
8. Aprire il coperchio e spingere delicatamente sullo stantuffo fino a quando la sezione di agarosio contenente l'embrione è appesa sotto il fondo capillare e si trova di fronte all'obiettivo (Figura 3C).
9. Disattivare Individua capillare e fare clic sul pulsante Individua campione (Figura 3A). Questo sposta la vista dalla webcam della camera campione all'obiettivo del microscopio (Figura 3D). Utilizzare questa vista per regolare la posizione del campione in modo più preciso. Disattivare Individua esempio (Figura 3A).
10. Passare alla scheda Acquisizione . Seleziona le caselle Z-Stack e Time Series.
11. Nella finestra Parametri modalità di acquisizione , scegliere l'impostazione Dual Side Lightsheet e selezionare le caselle per Online Dual Side Fusion e Pivot Scanning.
12. Nella finestra Canali , scegliere 488 canali, impostare la potenza del laser su 1 e il tempo di esposizione su 7,5 ms.
13. Quindi, fai clic sul pulsante Continuo per ottenere una visione dal vivo dell'embrione. Utilizzare il pannello di controllo ErgoDrive per regolare la posizione dell'embrione fino a quando il campo oculare non è direttamente rivolto verso la fotocamera. Continuate a regolare i fogli luminosi sinistro e destro nei parametri Canali fino a quando il campo oculare non è sufficientemente a fuoco.
14. Impostate i parametri Z-Stack utilizzando il pannello di controllo ErgoDrive per spostarvi attraverso il piano Z. Impostare la prima e l'ultima posizione Z intorno a 500 μm oltre l'ultimo segnale fluorescente rilevabile. Ciò lascia spazio al campo oculare per rimanere nell'inquadratura mentre l'embrione cresce durante la sessione di imaging time-lapse. Dopo aver impostato l'intervallo dello Z-Stack, fare clic sul pulsante Ottimale per impostare la dimensione del passo su 0,477 μm, l'impostazione ottimale.
15. Impostare i parametri di incubazione selezionando la casella dell'unità Peltier per mantenere la temperatura a 28 °C. Nella finestra Serie temporali scegliere la frequenza e l'intervallo di tempo per acquisire le immagini. In questo protocollo, i parametri sono stati impostati su immagine ogni 5 minuti, per un totale di 166 intervalli.
16. Fai clic sul pulsante Avvia esperimento . Scegliere la cartella in cui salvare il set di immagini. Imposta il prefisso dell'immagine e premi Salva per avviare l'imaging.
    NOTA: il microscopio eseguirà ora ogni immagine impostata all'intervallo specificato.
17. Una volta completata la sessione di imaging time-lapse, inviare lo stage nella posizione di carico e rimuovere il portacampioni capillare. Smontare il portacampioni capillare nell'ordine inverso in cui è stato assemblato e utilizzare lo stantuffo per rimuovere il campione e l'agarosio in eccesso dal capillare. Apri la porta della camera. Utilizzare la siringa per rimuovere il liquido della camera dalla camera, scollegare e rimuovere la camera, quindi risciacquare con acqua e asciugare all'aria.

3. Analisi delle immagini

1. Aprire il programma software arivis Vision4D.
2. Fai clic su File, quindi scegli Importa file. Selezionare tutti i file .czi dalla sessione di imaging time-lapse e aprirli. Si apre la finestra successiva con le opzioni su come importare i file; selezionate Z-stacks come Frames per ordinare gli z-stack nell'ordine ottenuto. Una volta importati i file, il software salva come singolo file .sis. Per specificare il percorso del file da salvare, selezionare la cartella prima di fare clic su Importa.
3. Dopo l'importazione del file, arivis è ora pronto per eseguire il rendering di un video delle immagini time-lapse. Fare clic sul cubo del visualizzatore 4D nell'angolo in basso a sinistra e sull'icona della barra della scala (Figura 4D-E). Fare clic sull'icona del video per portare la barra delle applicazioni dello storyboard nella parte inferiore dello schermo (Figura 4C).
4. Nella barra delle applicazioni dello storyboard , scegliete Aggiungi sequenza fotogramma chiave (Figura 4F). Specifica la durata del video in secondi, deseleziona la casella Crea rotazione e seleziona Usa progressione tempo per includere i timepoint specifici nel video. Il software visualizza questi parametri a destra della barra delle applicazioni dello storyboard per eventuali regolazioni in qualsiasi momento. Salvare lo storyboard per applicare gli stessi parametri a più set di immagini (Figura 4F).
5. Fare clic su Esporta filmato per salvare un video dell'imaging time-lapse (Figura 4F). Specifica le impostazioni di esportazione del filmato, inclusi il nome e la posizione del file, il formato video (.mp4), la risoluzione video (1.080 p), la frequenza fotogrammi (60 FPS) e la risoluzione dei dati (1.297 x 1.297 x 784). Aggiungi timestamp qui, se lo desideri. Una volta impostati questi parametri, scegliere Registra (Figura 4F).
6. I passaggi 3.4 e 3.5 possono essere ripetuti con la modifica al passaggio 3.4 per creare video di rotazione in punti temporali specifici. Quando aggiungete una sequenza di fotogrammi chiave allo storyboard, selezionate la casella Crea rotazione (Create Rotation ) e deselezionate Usa progressione temporale (Use Time Progression). Quindi, seguire le stesse istruzioni del passaggio 3.5.
7. Per eseguire il rendering di un'immagine ad alta risoluzione con qualsiasi orientamento in un singolo punto temporale, selezionare l'icona Fotocamera nel Visualizzatore 4D per ottenere un'immagine ad alta risoluzione (Figura 4C).
8. Per creare una pipeline per l'analisi, scegliete l'icona Fiasco per accedere al pannello Analisi (Figura 4B). Nel pannello Analisi , fate clic sul menu a discesa Operazioni di analisi . Ad esempio, il protocollo illustra di seguito la sequenza di operazioni per una pipeline di analisi del volume. Eseguite o annullate ogni passaggio della pipeline singolarmente per ottimizzare ogni parametro (Tabella 1).
9. Fate clic sul triangolo blu nella parte superiore della tubazione per consentire l'esecuzione della tubazione.
   NOTA: questa operazione richiederà del tempo a seconda della velocità del computer. Una volta ottimizzata la pipeline, la pipeline può essere esportata e importata in arivis con facilità e applicata a più set di dati in un'analisi batch.
10. Per accedere all'analisi batch, fare clic su Analisi batch nella scheda Analisi .
11. Dopo l'esecuzione della tubazione, viene visualizzata una finestra con tutti gli oggetti trovati. Accedere manualmente tramite l'icona Tabella (Figura 4B). Nella parte superiore di questa finestra, fare clic sulla casella Colonne feature per visualizzare un elenco di funzionalità in grado di fornire informazioni sull'oggetto di interesse. Per l'analisi del volume del campo oculare, queste caratteristiche includono Superficie, Volume (Volume, VoxelCount), Intensità #1 (Media), Attributi (Id, Tipo) e Punto temporale (Primo). Fare clic su Esporta per esportare i dati in un foglio di calcolo.

Results

Il set di dati visualizzato qui è stato ripreso utilizzando il protocollo descritto sopra. Un embrione Tg(Rx3:GFP) è stato ripreso a partire dallo stadio 1 somite (ss) attraverso 24 hpf, un periodo di tempo totale di 14 h, con le immagini acquisite a intervalli di 5 minuti. L'imaging time-lapse consente una facile selezione e confronto di qualsiasi punto temporale che mostri un fenotipo di interesse. Nella Figura 5 viene illustrato un insieme di immagini ad alta risoluzione di cui è stato eseguito il rendering dal punto di osservazione dorsale in determinati punti temporali di sviluppo. La pipeline eseguita in arivis Vision4D costruisce una maschera che rappresenta l'occhio in via di sviluppo identificato dal segnale fluorescente. Nella Figura 5 e nei Video 1-6, la maschera può essere visualizzata rispetto alla resa fluorescente dell'occhio in via di sviluppo. Inoltre, la Tabella 2 visualizza i dati del volume dall'occhio in via di sviluppo in ogni punto di imaging. Questo set di dati include il nome del segmento, l'id, il volume sia nel conteggio μm³ che voxel, l'intensità media di fluorescenza dell'oggetto, il punto temporale in cui l'oggetto è stato identificato e la superficie dell'oggetto in μm². È importante notare che quando il campo oculare si separa in due vescicole ottiche (a partire dal Timepoint 64), rimane una terza regione che è Rx3: GFP positiva nel proencefalo, che contribuirà all'ipotalamo^38,39,40 (Figura 5D-M). Ciò si manifesta nei dati di volume rappresentati nella Tabella 2 (evidenziati in giallo a partire dal timepoint 71) e può essere facilmente separato dalle vescicole ottiche, poiché è molto più piccolo in volume rispetto a entrambe le vescicole ottiche.

Figura 1: Preparazione del campione. (A) Posizionamento degli embrioni in un capillare di vetro. La freccia indica un embrione nel capillare. (B) Parti di capillari e capillari di vetro. (C) Supporto capillare parzialmente assemblato. (D) Supporto capillare completamente assemblato. (E) Camera di montaggio Lightsheet. La freccia indicava la linea bianca utilizzata per orientare il supporto capillare. (F) Supporto capillare correttamente montato nel Lightsheet. La freccia mostra le linee bianche corrispondenti, indicando il corretto orientamento del supporto capillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione dell'imaging Lightsheet. (A) Centralino per accendere Lightsheet, il computer e l'unità di incubazione. I numeri indicano l'ordine delle operazioni. (B) Camera obiettivo Lightsheet. (C) Camera di imaging. (D) Siringa e tubo che saranno collegati alla camera di imaging. (E) La camera di imaging correttamente posizionata all'interno della camera obiettivo con tutti i tubi collegati alle porte appropriate a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Posizionamento del campione. (A) Individuare i pulsanti Capillary e Locate Sample nel software Zen come indicato dalle frecce. (B) Il posizionamento sul capillare di vetro. La freccia indica il bordo del capillare di vetro posizionato appena sopra la lente dell'obiettivo. C) La sospensione embrionale oltre il capillare di vetro. La freccia indicava l'embrione sospeso in agarosio sotto il capillare di vetro davanti alla lente dell'obiettivo. (D) Visione dell'embrione attraverso l'obiettivo. (E) Il pannello di controllo ErgoDrive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Icone importanti per la navigazione in arivis Vison4D. Ogni pannello ha la funzione icona identificata da sinistra a destra. (a) Apri, Salva, Chiudi. (b) Pannello Analisi, Mostra tabella oggetti, Editor traccia aperta. (C) Copia il contenuto del visualizzatore corrente come immagine negli Appunti, Attiva/disattiva Segnalibri, Crea un'immagine ad alta risoluzione per la visualizzazione corrente, Attiva/disattiva storyboard. (D) Mostra casella di misura, Mostra croce di orientamento, Mostra legenda, Mostra barra scala. (E) Mostra come visualizzatore 2D, Mostra come visualizzatore galleria, Mostra come visualizzatore 4D, Mostra come visualizzatore informazioni, Mostra come visualizzatore di proiezione. F) Aggiorna tutti i fotogrammi chiave, Aggiungi fotogramma chiave, Aggiungi sequenza fotogramma chiave, Inserisci fotogramma chiave, Rimuovi tutti i fotogrammi chiave, Esporta filmato, Carica storyboard, Salva storyboard, Regola l'ora di destinazione dell'intero filmato, Primo fotogramma chiave, Riproduci, Pausa, Stop, Ultimo fotogramma chiave. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini ad alta risoluzione e maschere del campo oculare. (A-M) Un insieme di immagini ad alta risoluzione che sono state renderizzate dai punti di osservazione dorsali; (A'-M') le maschere del campo oculare per ogni punto temporale corrispondente. Ogni set di immagini è annotato dal momento in cui è stato acquisito dall'inizio dell'imaging e dal corrispondente stadio di sviluppo nello stadio somite (ss) o nelle ore successive alla fecondazione (hpf). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Video time-lapse di Tg(rx3:GFP) embrione di zebrafish da 1 ss-24 hpf. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come).

Video 2: Video time-lapse dell'embrione di zebrafish Tg(rx3:GFP) da 1 ss-24 hpf con il campo oculare identificato dalla pipeline arivis Vision4D. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come). 

Video 3: Rotazione a 360° di un embrione di zebrafish Tg(rx3:GFP) a 1 ss. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come). 

Video 4: Rotazione a 360 ° di una maschera per campo oculare embrionale di zebrafish Tg (rx3: GFP) a 1 ss. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come). 

Video 5: Rotazione a 360° di un embrione di zebrafish Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come). 

Video 6: Rotazione a 360° di una maschera da campo oculare embrionale di zebrafish Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Fare clic con il pulsante destro del mouse qui per scaricare il video (salva il link come). 

Tabella 1: pipeline arivis Vision4D per l'analisi del volume del campo oculare in via di sviluppo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Volume e superficie del campo oculare in via di sviluppo acquisito da arivis Vision4D. Le righe relative al presunto ipotalamo sono evidenziate in giallo per distinguerle dalle vescicole ottiche. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

In questo protocollo, il microscopio Lightsheet è stato utilizzato per eseguire l'imaging time-lapse dello sviluppo oculare e sono stati analizzati i dati risultanti. Il set di dati risultante può fornire preziose informazioni sul processo di morfogenesi oculare, nonché perturbazioni a questo processo a seguito di mutazioni genetiche, esposizione ad agenti farmacologici o altri parametri sperimentali. Qui il protocollo ha dimostrato come questo set di dati può essere ottenuto e ha fornito un esempio di come analizzare il volume del campo oculare attraverso lo sviluppo iniziale. Questi dati sono risultati riproducibili e coerenti (variazione inferiore al 10% in volume) tra le repliche biologiche, tenendo presente che lievi differenze nella stadiazione dell'embrione prima dell'inizio della corsa possono portare a qualche variazione nelle misurazioni del volume finale.

Bisogna fare attenzione nel posizionamento iniziale dell'embrione nel capillare e nel posizionare l'embrione incorporato davanti all'obiettivo. L'orientamento svolge un ruolo importante nell'impedire all'embrione di crescere e allontanarsi dalla visione dell'obiettivo. Gli embrioni hanno una forma rotonda a 10 hpf, il che rende difficile garantire un orientamento specifico nel capillare. Idealmente, il corpo dell'embrione sarà posizionato lateralmente nel capillare. Caricare più embrioni nel capillare aumenterà la probabilità di avere un embrione ben posizionato.

In questa procedura, l'embrione viene incorporato nell'agarosio per sospenderlo di fronte agli obiettivi di imaging e illuminazione. La scelta della corretta concentrazione dell'agarosio a bassa temperatura di fusione è fondamentale. Una concentrazione troppo alta restringerà l'embrione e gli impedirà di svilupparsi correttamente; una concentrazione troppo bassa farà sì che l'agarosi cada a pezzi e non tenga l'embrione. La concentrazione ottimale per questo protocollo è una concentrazione finale dell'1% a bassa temperatura di fusione agarosio^30,31.

Un altro elemento che dovrebbe essere preso in considerazione è il livello di saturazione. Man mano che il campo oculare cresce e si differenzia, la forza del segnale Rx3:GFP si intensifica. Pertanto, quando si impostano i parametri di imaging iniziali, l'esposizione e la potenza del laser devono essere ridotte per sottosaturare l'immagine. Ciò impedirà all'immagine di diventare sovrasatura man mano che la Rx3:GFP diventa più luminosa nel tempo. È possibile apportare modifiche per correggere la sottosaturazione nell'elaborazione delle immagini, ma la sovrasaturazione non può essere corretta dopo che le immagini sono state acquisite.

Ci sono alcune modifiche aggiuntive che possono essere apportate a questo protocollo che possono essere vantaggiose per alcuni progetti che non sono descritti in questo documento. Ad esempio, è possibile impostare l'imaging Multiview nella configurazione dell'acquisizione delle immagini. Questo parametro consentirebbe di visualizzare sequenzialmente più embrioni in posizioni diverse lungo l'asse y ad ogni intervallo di tempo. Pur aggiungendo complessità al set di dati, aumenterebbe la velocità di raccolta dei dati. Inoltre, in termini di elaborazione delle immagini, è possibile quantificare il campo oculare in base ad altri parametri. Qui, abbiamo descritto come quantificare i dati in termini di volume del campo oculare. In alternativa, potrebbe essere fatta una pipeline per quantificare e tracciare le singole cellule o determinare il tasso di evaginazione delle vescicole ottiche.

Come accennato in precedenza, sia la microscopia confocale che lightsheet sono state utilizzate per eseguire studi di imaging time-lapse del pesce zebra. Lightsheet è stato scelto appositamente per questo progetto per la sua superiore capacità di ripresa attraverso un campione spesso (>1 mm), perché è dotato di un'unità di incubazione per mantenere un ambiente di temperatura ideale per l'embrione di zebrafish e perché la sua capacità di visualizzare a una velocità più veloce rispetto alla microscopia confocale consente l'acquisizione di immagini ai numerosi intervalli di tempo richiesti per questo protocollo senza danni di accompagnamento o fotosbiancamento dell'embrione^21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. È anche importante notare che il microscopio Lightsheet è attrezzato per visualizzare il segnale da più fluorofori. Il microscopio Lightsheet utilizzato in questo studio ha linee di eccitazione laser a stato solido a 405, 445, 488, 515, 561 e 638 nm, che potrebbero essere utili per l'imaging di embrioni transgenici che esprimono più di un transgene reporter fluorescente.

Mentre questo protocollo descrive le istruzioni per l'analisi dell'acquisizione delle immagini in particolare utilizzando il sistema di microscopi a doppia illuminazione Lightsheet Z.1 e il software di analisi arivis Vision4D, ci sono altri microscopi Lightsheet disponibili in commercio realizzati da Leica, Olympus e Luxendo, nonché il software di analisi delle immagini di Imaris, che potrebbero essere utilizzati per ottenere risultati simili. La selezione di apparecchiature e software per questo protocollo è stata determinata dalla disponibilità presso la nostra istituzione.

In sintesi, si prevede che questo protocollo fornirà un solido punto di partenza per condurre l'imaging time-lapse utilizzando la microscopia Lightsheet e per la quantificazione dell'immagine dello sviluppo precoce dell'occhio nel pesce zebra.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringa da 60 ml Luer-Lok Tip	BD	309653
agarosio, bassa temperatura di fusione	Promega	V2111
arivis Vision4D Software	arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Pinze	Dumont	0203-N3C-PO
tampone pesce E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)
Capillare in vetro ... Misura 2 (~1mm)	Zeiss	Nero/701904
Heidelberger Extension Line 100cm	B. Braun	4097262
Light & Set di filtri – Royal Blue	Night Sea	SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm)	VWR	25384-302
Stereomicroscopio Adattatore per fluorescenza	NightSea
Stantuffo con punta in teflon ... Taglia 2	Zeiss	#701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish		Questa linea è stata fondata da Rembold et al.13
Tricaine (MS222)	Sigma	A-5040
Z.1 Lightsheet	Zeiss
Zen Software	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html