Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

Abstract

Il trapianto di cellule retiniche è un approccio terapeutico promettente, che potrebbe ripristinare l'architettura retinica e stabilizzare o addirittura migliorare le capacità visive della retina degenerata. Tuttavia, i progressi nella terapia di sostituzione cellulare devono attualmente affrontare le sfide di richiedere una fonte pronta all'uso di retine umane standardizzate e di alta qualità. Pertanto, è necessario un protocollo facile e stabile per gli esperimenti. Qui, sviluppiamo un protocollo ottimizzato, basato su un metodo auto-organizzante con l'uso di molecole esogene e reagente A e l'escissione manuale per generare gli organoidi tridimensionali della retina umana (RO). La RO derivata dalle cellule staminali pluripotenti umane (PSC) esprime marcatori specifici per i fotorecettori. Con l'aggiunta di COCO, un antagonista multifunzionale, l'efficienza di differenziazione dei precursori e dei coni dei fotorecettori è significativamente aumentata. L'uso efficiente di questo sistema, che ha i vantaggi delle linee cellulari e delle cellule primarie, e senza i problemi di approvvigionamento associati a queste ultime, potrebbe produrre cellule retiniche confluenti, in particolare fotorecettori. Pertanto, la differenziazione delle PSC in RO fornisce una piattaforma ottimale e biorilevante per la modellizzazione della malattia, lo screening farmacologico e il trapianto di cellule.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono caratterizzate dal loro auto-rinnovamento e dalla capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche. Pertanto, gli organoidi derivati dalle PSC sono diventati una risorsa importante nella ricerca sulla medicina rigenerativa. La degenerazione retinica è caratterizzata dalla perdita di fotorecettori (coni e bastoncelli) e dall'epitelio pigmentato retinico. La sostituzione delle cellule retiniche potrebbe essere un trattamento incoraggiante per questa malattia. Tuttavia, non è possibile ottenere retine umane per la ricerca e la terapia della malattia. Pertanto, gli organoidi retinici (RO) derivati dalle PSC, che ....

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato etico istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. Le hESC H9 sono state ottenute dal WiCell Research Institute e geneticamente modificate su linea cellulare tdTomato-tagged.

1. Generazione di RO umane

1. Coltura degli hESC in condizioni prive di alimentatore.
   1. Rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di reagente A da 0,1 mg/mL (Tabella dei materiali) a 37 °C per almeno mezz'ora seguendo le istruzioni del fabbricante. Scongelare un'aliquota di 1x10⁶ hESC.
      NOTA: Preparare 3 ml di reagente B preriscaldato (

Results

L'illustrazione schematica illustra il protocollo di differenziazione per migliorare le cellule precursori con COCO (Figura 1). Da PSC a RO, numerosi dettagli potrebbero causare variazioni di risultato. Si consiglia di registrare ogni fase e anche il numero di catalogo e il numero di lotto di ogni mezzo per tracciare l'intera procedura.

Qui, forniamo immagini in campo chiaro per i giorni 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). Il giorno 6, gli org.......

Discussion

La differenziazione organoide retinica è un metodo auspicabile per la generazione di ampie cellule retiniche funzionali. Il RO è un composto di diverse cellule retiniche, come cellule ganglionari, cellule bipolari e fotorecettori, generate da cellule staminali pluripotenti verso la retina neurale 4,5,8,9. Sebbene i RO confluenti possano essere raccolti, richiede molto tempo, il che può richiede.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoetanolo	Life Technologies	21985-023
COCO	R& D Systems	3047-CC-050	DAN Domain Famiglia di antagonisti BMP
DEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Siero fetale bovino (FBS), qualificato per l'industria biologica delle cellule staminali embrionali umane		04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
KnockOut Serum Replacement-Multi-Species	Gibco	A3181502
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)	Sigma	M7145
Pen Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plate	Sbio	MS9096SZ	Aggregazione cellulare in 1.2.7
piruvato	Sigma	S8636
Reagente A	BD	356231	Matrigel in 1.1.1
Reagente B	StemCell	5990	mTeSR- E8 , PSCs terreno basale in 1.1.2
Reagente C	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2
Reagente D	Roche	11284932001	DNasi I , in 1.2
Acido retinoico	Sigma	R2625-100MG
SAG	Enzo Life Science	ALX-270-426-M001
Integratore 1	Life Technologies	17502-048	N-2 Integratore (100X), Liquido, supplemet in medum III
Taurina	Sigma	T-8691-25G
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Gibco	25200056	organoidi dissociazione in 2.1.3
Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem	Sigma	681669	Inibitore di Wnt
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049