Articolo metodologico

CcCIPK14 Analisi della funzione genica per illuminare l'efficiente sistema transgenico radicale

DOI:

10.3791/62304

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23 settembre 2021

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1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un sistema di trasformazione efficiente e stabile per l'analisi funzionale del gene CcCIPK14 come esempio, fornendo una base tecnica per lo studio del metabolismo di piante non modello.

Abstract

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Un sistema di trasformazione efficiente e stabile è fondamentale per lo studio della funzione genica e il miglioramento genetico molecolare delle piante. Qui, descriviamo l'uso di un sistema di trasformazione mediato da Agrobacterium rhizogenes su pisello piccione. Lo stelo è infettato da A. rhizogenes che trasporta un vettore binario, che induce il callo dopo 7 giorni e le radici avventizie 14 giorni dopo. La radice pelosa transgenica generata è stata identificata mediante analisi morfologica e un gene reporter GFP. Per illustrare ulteriormente il campo di applicazione di questo sistema, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) è stato trasformato in pisello piccione utilizzando questo metodo di trasformazione. Le piante transgeniche sono state trattate rispettivamente con acido jasmonico (JA) e acido abscissico (ABA), allo scopo di verificare se CcCIPK14 risponde a tali ormoni. I risultati hanno dimostrato che (1) gli ormoni esogeni potrebbero sovraregolare significativamente il livellodi espressione di CcCIPK14, specialmente nelle piante con sovraespressione (OE) di CcCIPK14 ; (2) il contenuto di genisteina nelle linee CcCIPK14-OE era significativamente superiore a quello del controllo; (3) il livello di espressione di due geni chiave della flavonoide sintasi a valle, CcHIDH1 e CcHIDH2, è stato up-regolato nelle linee CcCIPK14-OE; e (4) il sistema transgenico della radice pelosa può essere utilizzato per studiare geni metabolicamente funzionali in piante non modello.

Introduzione

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La trasformazione è uno strumento fondamentale per valutare l'espressione di geni esogeni 1,2. Molti aspetti biologici delle piante da risorsa sono comuni a tutte le piante; pertanto, gli studi funzionali di alcuni geni possono essere effettuati in piante modello (come l'Arabidopsis)3. Tuttavia, molti geni nelle piante sono unici nei loro modelli di funzione ed espressione, richiedendo studi su specie proprie o strettamente correlate, in particolare per le piante risorsa 3,4. Le cellule....

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Protocollo

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NOTA: Il pisello piccione è una coltura di leguminose diploidi che appartiene alla famiglia delle Fabaceae. I semi di pisello piccione utilizzati in questo esperimento provengono dalla Northeast Forestry University of China e sono codificati 87119. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1A. L'incubazione delle piantine è stata eseguita in un ambiente ad alta umidità a 25 °C sotto luci fluorescenti a 50 μmol di fotoni per m-2 s-1 in un fotoperiodo di 16 ore. I ceppi K599 (NCPPB2659) di A. rhizogenes sono stati conservati in laboratori....

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Risultati

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Trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes su pisello piccione
Questo studio ha descritto i protocolli passo-passo per la trasformazione genetica delle radici pelose mediata da A. rhizogenes, che ha significato nel campo delle molecole vegetali. Ci sono volute circa 5 settimane per ottenere radici pelose dalle radici del pisello piccione infettato da A. rhizogenes. La Figura 1A ha mostrato una .......

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Discussione

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La rapida caratterizzazione della funzione genica è l'obiettivo comune nello studio della maggior parte delle specie, ed è particolarmente importante per lo sviluppo delle piante da risorsa. La trasformazione mediata da A. rhizogenes è stata ampiamente utilizzata nella coltura delle radici pelose. La coltura delle radici pelose (HRC), come fonte unica di produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica18,28

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (31800509, 31922058), dell'Outstanding Young Talent Fund dell'Università forestale di Pechino" (2019JQ03009), dei fondi per la ricerca di base per le università centrali (2021ZY16), della Beijing Municipal Natural Science Foundation (6212023) e del National Key R&D Program of China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) e del Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design. Desidero ringraziare Zhengyang Hou per la sua guida nella stesura dell'articolo e il professor Meng Dong per la sua guida sull'idea....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta qPCR da 0,1 mL a 8 strisce (con tappi ottici)KIRGEN, Shanghai, CinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Pechino, CinaA8060
Agar in polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaA8190
CentrifugaOsterode am Harz, Germaniad37520
CFX Connect TW Optics ModuleBio-rad, US1855200
incubatore a temperatura costanteShanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai, CinaBPX-82
Piatto di Petri monousoCorning, US
Dry Bath GingkoBioscience Company/Coyote bioscience, CinaH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Pechino, CinaLS1030
Bilancia elettronicaTianjin, CinaTD50020
Filtro papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, Cina
FiveEasy PlusMettler Toledo, Shanghai, Cina30254105
Flowerpot 9*9Cina
JASolarbio Life Science, Pechino, CinaJ8070
KanSolarbio Life Science, Pechino, CinaK8020
MagicSYBR MiscelaCWBIO, Pechino, Cina
Mini MicrocentrifugaScilogex, Pechino, CinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Pechino, CinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, GermaniaT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, Pechino, CinaR8010
Scatola per piantine 30 * 200China
Thermal  Cycler  PCRBio-rad, oscillatoreT100
donglian Har lnstrument Manufacture Co., Ltd, CinaDLHE-Q200
Tomy AutoclaveTomy, GiapponeSX-500
TryptoneSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA synthesis (con dsDNase)US Everbright INC, Jiangsu, CinaR2028
Estratto di lievito in polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0021
CW3008M termostatico US Beijing

Riferimenti

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  1. Poland, J. A., Rife, T. W. Genotyping-by-sequencing for plant breeding and genetics. The Plant Genome. 5 (3), (2012).
  2. Barabaschi, D., et al. Next generation breeding. Plant Science. 242, 3-13 (2016).
  3. Petri, C., Webb, K., Hily, J. -M., Dardick, C., Scorza, R.

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Ristampe e permessi

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CcCIPK14 GeneHairy Root TransformationAgrobacterium RhizogenesPigeon PeaTransgenic Hairy RootGene Function AnalysisJasmonic Acid TreatmentAbscisic Acid ResponseFlavonoid Synthase GenesGenistein Content
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