Method Article

CcCIPK14 Analisi della funzione genica per illuminare l'efficiente sistema transgenico radicale

DOI:

10.3791/62304

⸱

September 23rd, 2021

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1College of Forestry, Beijing Forestry University, 2Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un sistema di trasformazione efficiente e stabile per l'analisi funzionale del gene CcCIPK14 come esempio, fornendo una base tecnica per lo studio del metabolismo di piante non modello.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un sistema di trasformazione efficiente e stabile è fondamentale per lo studio della funzione genica e il miglioramento genetico molecolare delle piante. Qui, descriviamo l'uso di un sistema di trasformazione mediato da Agrobacterium rhizogenes su pisello piccione. Lo stelo è infettato da A. rhizogenes che trasporta un vettore binario, che induce il callo dopo 7 giorni e le radici avventizie 14 giorni dopo. La radice pelosa transgenica generata è stata identificata mediante analisi morfologica e un gene reporter GFP. Per illustrare ulteriormente il campo di applicazione di questo sistema, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) è stato trasformato in pisello piccione utilizzando questo metodo di trasformazione. Le piante transgeniche sono state trattate rispettivamente con acido jasmonico (JA) e acido abscissico (ABA), allo scopo di verificare se CcCIPK14 risponde a tali ormoni. I risultati hanno dimostrato che (1) gli ormoni esogeni potrebbero sovraregolare significativamente il livellodi espressione di CcCIPK14, specialmente nelle piante con sovraespressione (OE) di CcCIPK14 ; (2) il contenuto di genisteina nelle linee CcCIPK14-OE era significativamente superiore a quello del controllo; (3) il livello di espressione di due geni chiave della flavonoide sintasi a valle, CcHIDH1 e CcHIDH2, è stato up-regolato nelle linee CcCIPK14-OE; e (4) il sistema transgenico della radice pelosa può essere utilizzato per studiare geni metabolicamente funzionali in piante non modello.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La trasformazione è uno strumento fondamentale per valutare l'espressione di geni esogeni 1,2. Molti aspetti biologici delle piante da risorsa sono comuni a tutte le piante; pertanto, gli studi funzionali di alcuni geni possono essere effettuati in piante modello (come l'Arabidopsis)3. Tuttavia, molti geni nelle piante sono unici nei loro modelli di funzione ed espressione, richiedendo studi su specie proprie o strettamente correlate, in particolare per le piante risorsa 3,4. Le cellule vegetali possono percepire vari segnali che consentono alle piante di mostrare cambiamenti specifici nell'espressione genica, nel metabolismo e nella fisiologia in risposta a diverse condizioni di stress ambientale 5,6,7. I flavonoidi sono attori cruciali nel processo di segnalazione delle piante che rispondono agli stress ambientali 5,8,9. Inoltre, il contenuto di flavonoidi nelle piante orticole e medicinali è anche un indicatore importante per la valutazione della qualità10. L'identificazione di geni coinvolti nella regolazione della sintesi dei flavonoidi in risposta a segnali esterni è fondamentale per comprendere il meccanismo della sintesi dei flavonoidi nelle piante. Diversi studi hanno rivelato che l'applicazione di ormoni esogeni può favorire l'accumulo di flavonoidi 6,11. Un sistema di trasformazione stabile e un metodo di convalida della funzione genica sono essenziali per dimostrare la funzione dei geni e per comprendere il metabolismo secondario nelle piante.

La trasformazione mediata da agrobatterio è ampiamente utilizzata nell'inserimento del DNA 5,8,9. L'Agrobacterium tumefacient può trasferire geni ad anello nei cromosomi delle cellule vegetali e i fitormoni esogeni inducono una o poche cellule ospiti in grado di rigenerare le piante per ottenere trasformanti stabili 12,13,14. I metodi di trasformazione mediati da Agrobacterium tumefacient sono più applicabili a specie vegetali adatte alla manipolazione in vitro, mentre la maggior parte delle piante legnose perenni limita l'applicazione di questo metodo a causa della loro difficoltà di rigenerazione 4,15. A. rhizogenes è anche in grado di modificare il genoma delle cellule ospiti16. Nel presente studio, abbiamo sviluppato una procedura di trasformazione mediata da A. rhizogenes efficiente e stabile. A. rhizogenes contiene un secondo plasmide binario che trasporta il gene non naturale T-DNA oltre al plasmide Ri. La pianta ospite è infetta e si può ottenere una pianta composita con radici pelose transgeniche che emergono dal germoglio di tipo selvatico16,17. I sistemi di trasformazione mediati da A. rhizogenes sono adatti per l'applicazione nella ricerca sulle piante legnose grazie alla loro rigenerazione rapida, a basso costo e non richiesta. Più di 160 tipi di piante hanno indotto con successo radici pelose, e la maggior parte delle quali si trova in Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Convolvulaceae, Ombrellifere, Leguminose, Caryophyllaceae e Polygonaceae18,19. Rispetto ad A. tumefaciens, A. rhizogenes ha mostrato una maggiore efficienza nella trasformazione mediata del pisello17,20.

In questo studio, il pisello piccione è stato utilizzato come esempio per introdurre il processo di trasformazione mediato da A. rhizogenes. Dall'inoculazione alla radicazione, gli esperimenti sono durati 5 settimane. Abbiamo identificato la trasformazione della radice avventizia attraverso la morfologia e il gene reporter GFP, e l'efficienza di trasformazione è stata del 75%. Inoltre, abbiamo trattato l'impianto composito con JA e ABA, oltre a rilevare trascritti e metaboliti secondari mediante real-PCR quantitativa e HPLC (cromatografia liquida ad alte prestazioni). È confermato che il livello di espressione di CcCIPK14 risponde non solo a JA e ABA, ma influenza anche la biosintesi dei flavonoidi. Questo sistema è adeguato per lo studio dei geni funzionali associati al metabolismo secondario. Fornisce inoltre un nuovo approccio allo studio di piante non modello in mancanza di un sistema di trasformazione stabile sufficiente 17,21,22.

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Protocol

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NOTA: Il pisello piccione è una coltura di leguminose diploidi che appartiene alla famiglia delle Fabaceae. I semi di pisello piccione utilizzati in questo esperimento provengono dalla Northeast Forestry University of China e sono codificati 87119. I passaggi principali di questo protocollo sono illustrati nella Figura 1A. L'incubazione delle piantine è stata eseguita in un ambiente ad alta umidità a 25 °C sotto luci fluorescenti a 50 μmol di fotoni per m-2 s-1 in un fotoperiodo di 16 ore. I ceppi K599 (NCPPB2659) di A. rhizogenes sono stati conservati in laboratorio. Sono stati conservati in terreno di mannitolo di lievito (YEP) con glicerolo al 15% a -80 °C. Il protocollo descritto in questo lavoro si basava sul protocollo Meng et al.21.

ATTENZIONE: Depositare tutti i batteri e le piante geneticamente modificate nell'apposito contenitore per rifiuti. Utilizzare tutte le sostanze chimiche pericolose in una cappa aspirante e smaltirle nel contenitore per rifiuti pericolosi.

1. Preparazione delle piantine di piselli piccione

  1. Scegli semi di pisello piccione carnosi e non danneggiati (Figura 1A) che sono stati conservati per meno di 1 anno.
  2. Immergere i semi in acqua distillata per 24 ore (Figura 1B). Trasferisci i semi gonfi in un vassoio per semi e mettili nella serra.
  3. I semi iniziano a germogliare dopo 1-2 giorni. Quando l'epicotile raggiunge 1,5 cm, trapiantare le piantine in vasi di 10 cm (diametro) x 9 cm (altezza) contenenti terra e sabbia in un rapporto di volume di 3:1.
    NOTA: Il terreno è costituito da una miscela di terreno nutriente, vermiculite e perlite in un rapporto 2:1:1.
  4. Coltiva la piantina in una serra.

2. Attivazione di A. rhizogenes

NOTA: Il ceppo utilizzato per la trasformazione di A. rhizogenes era il K599 conservato a -80 °C. Il vettore binario pROK2 (pBIN438; http://www.biovector.net/product/428388.html) contiene la proteina fluorescente verde (GFP) come gene indicatore e un gene di resistenza alla kanamicina come marcatore selezionabile per trasformare A. rhizogenes.

  1. Scongelare A. rhizogenes sul ghiaccio.
  2. Immergere i batteri e allinearli uniformemente su terreno di mannitolo di lievito (YEP) integrato con 8 g/L di polvere di agar, 25 mg/L di rifampicina e 25 mg/L di kanamicina (YRK, pH 7,0).
  3. Incubare a 28 °C per 16 h.
  4. Selezionate le colonie monoclonali. Coltivarli in una provetta da 50 mL contenente 10 mL di terreno YEB integrato con 25 mg/L di rifampicina e 25 mg/L di kanamicina (YRK, pH 7,0). Posizionare la provetta da centrifuga su un'incubatrice vibrante con un raggio di rotazione di 10 cm, a 28 °C e 200 giri/min per 16 ore.

3. Trasformazione delle piante con A. rhizogenes

NOTA: Seleziona piante sane per infettare A. rhizogenes utilizzando la seguente procedura di iniezione. Questa procedura si traduce in radici pelose trasformate. Per analizzare la funzione genica di CcCIPK14, è necessario un controllo. Le soluzioni di A. rhizogenes con vettore vuoto o plasmidi CcCIPK14-pROK2 sono state iniettate nelle piantine per indurre radici pelose.

  1. Inoculare A. rhizogenes
    1. Scegli piantine di piselli piccioni con lo stesso stato di crescita.
    2. Svuotare l'aria dalla siringa da 1 ml e aspirare 0,3 ml di liquido batterico. Spingere lentamente l'asta di spinta per riempire l'ago della siringa con liquido batterico21.
    3. Per prima cosa fissa il gambo della piantina di pisello piccione con una pinzetta, quindi infilza l'ago della siringa nel gambo a 1 cm.
    4. Quando si estrae la siringa, immergere completamente la punta dell'ago nello stelo. Spingere lentamente l'asta di spinta per pompare il liquido batterico fuori dalla ferita penetrante.
      NOTA: L'adesione del liquido batterico residuo alla ferita in goccioline di batteri può migliorare l'efficienza dell'infezione e della trasformazione.
  2. Gestione delle piantine
    NOTA: L'alta temperatura e l'umidità possono migliorare l'efficienza dell'infezione di A. rhizogenes.
    1. Metti le piantine inoculate con A. rhizogenes in un vassoio (30 cm x 60 cm x 6 cm) con 1 L di acqua. Utilizzare un coperchio di plastica trasparente (30 cm x 60 cm x 30 cm) come copertura per mantenere la temperatura e l'umidità dell'ambiente interno.
    2. Rimuovere periodicamente le foglie cadute e le ife flocculanti attaccate alle punte delle foglie e alle foglie cadute.
    3. Dopo una settimana, il callo inizia ad apparire nella ferita. Successivamente, tenere il coperchio di plastica semiaperto.
    4. Dopo 4-5 settimane, la maggior parte del tessuto del callo si è differenziata in radici avventizie. Rimuovere il coperchio di plastica.
    5. Aggiungere 1 litro d'acqua nella teglia ogni 3 giorni per mantenere il terreno umido.
      NOTA: Il pisello piccione è una pianta resistente alla siccità; Troppa acqua può inibire la crescita delle piante.

4. Identificazione delle radici pelose trasformate

NOTA: Le radici pelose trasformate possono essere identificate in base alla morfologia e al livello genico. Questa procedura si concentra principalmente sul test di identificazione del gene reporter (GFP).

  1. Raccogli le punte delle radici pelose e segna la parte rimanente.
  2. Valutare se c'è fluorescenza verde sotto un microscopio a scansione laser confocale.
  3. Triturare 0,1 g di radici pelose con forte segnale di fluorescenza in polvere fine in azoto liquido.
  4. Secondo le istruzioni del produttore del kit di DNA genomico vegetale, preparare il DNA genomico delle linee transgeniche indipendenti del pisello piccione con il metodo23 del bromuro di cetiltrimetilammonio modificato (CTAB).
  5. Utilizzare 500 ng di modello di DNA genomico e primer per la PCR. Gli inneschi sono riportati nella Tabella 1.
  6. Eseguire il seguente ciclo di amplificazione: pre-denaturazione a 94 °C per 5 min, denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura di primer a 55 °C per 30 s e prolungamento del primer a 72 °C per 30 s. Dopo 36 cicli e un'estensione finale di 10 minuti a 72 °C, analizzare i prodotti amplificati su un gel di agarosio all'1%.
  7. Colora i gel con la colorazione dell'acido nucleico e visualizzali sotto la luce UV.

5. Trattamento ormonale esogeno

NOTA: Le piante composite positive sono state trattate con ormoni esogeni per studiare l'effetto di CcCIPK14 sul metabolismo. Le piante composte indotte da A. rhizogenes sono state divise in tre gruppi: gruppo di trattamento JA, gruppo di trattamento ABA e gruppo di controllo (Figura 3A).

  1. Ridurre l'irrigazione 3 giorni prima del trattamento ormonale esogeno.
  2. Preparare entrambe le soluzioni JA e ABA a una concentrazione di 5 mg/L.
    NOTA: Le polveri di JA e ABA vengono prima sciolte in alcol etilico e poi riempite fino al volume target con acqua distillata.
  3. Utilizzando un flacone spray, spruzzare le soluzioni JA e ABA in modo uniforme sulle foglie delle piante. Trattare il gruppo di controllo con acqua.
    NOTA: Una media di 10 ml di soluzione è stata spruzzata su ogni piantina.
  4. Coprire con il coperchio di plastica subito dopo il trattamento a spruzzo. Rimettilo nella serra climatica artificiale.

6. Raccolta e conservazione dei campioni

NOTA: Dopo 3 ore di trattamento ormonale esogeno, sono stati raccolti materiali vegetali di diversi gruppi di trattamento.

  1. Rimuovi le radici pelose fulve e contaminate e seleziona quelle con un aspetto bianco. Raccogli queste radici pelose e asciugale con carta assorbente.
  2. Dividi le radici pelose raccolte da ogni piantina in due parti. Mettere una parte in una provetta numerata e avvolgerla con carta stagnola contrassegnata.
  3. Liofilizzare la carta stagnola in azoto liquido, quindi conservare tutta la carta stagnola raccolta a -80 °C per ulteriori indagini.

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Results

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Trasformazione della radice pelosa mediata da A. rhizogenes su pisello piccione
Questo studio ha descritto i protocolli passo-passo per la trasformazione genetica delle radici pelose mediata da A. rhizogenes, che ha significato nel campo delle molecole vegetali. Ci sono volute circa 5 settimane per ottenere radici pelose dalle radici del pisello piccione infettato da A. rhizogenes. La Figura 1A ha mostrato una ...

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Discussion

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La rapida caratterizzazione della funzione genica è l'obiettivo comune nello studio della maggior parte delle specie, ed è particolarmente importante per lo sviluppo delle piante da risorsa. La trasformazione mediata da A. rhizogenes è stata ampiamente utilizzata nella coltura delle radici pelose. La coltura delle radici pelose (HRC), come fonte unica di produzione di metaboliti, svolge un ruolo fondamentale nell'ingegneria metabolica18,28

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Acknowledgements

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Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (31800509, 31922058), dell'Outstanding Young Talent Fund dell'Università forestale di Pechino" (2019JQ03009), dei fondi per la ricerca di base per le università centrali (2021ZY16), della Beijing Municipal Natural Science Foundation (6212023) e del National Key R&D Program of China (2018YFD1000602,2019YFD1000605-1) e del Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design. Desidero ringraziare Zhengyang Hou per la sua guida nella stesura dell'articolo e il professor Meng Dong per la sua guida sull'idea dell'articolo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta qPCR da 0,1 mL a 8 strisce (con tappi ottici)KIRGEN, Shanghai, CinaKJ2541
ABASolarbio Life Science, Pechino, CinaA8060
Agar in polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaA8190
CentrifugaOsterode am Harz, Germaniad37520
CFX Connect TW Optics ModuleBio-rad, US1855200
incubatore a temperatura costanteShanghai Boxun Industry & Commerce Co., Ltd, Shanghai, CinaBPX-82
Piatto di Petri monousoCorning, US
Dry Bath GingkoBioscience Company/Coyote bioscience, CinaH2H3-100C
Eastep Total RNA Extraction Kit50Promega, Pechino, CinaLS1030
Bilancia elettronicaTianjin, CinaTD50020
Filtro papeHangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd, Cina
FiveEasy PlusMettler Toledo, Shanghai, Cina30254105
Flowerpot 9*9Cina
JASolarbio Life Science, Pechino, CinaJ8070
KanSolarbio Life Science, Pechino, CinaK8020
MagicSYBR MiscelaCWBIO, Pechino, Cina
Mini MicrocentrifugaScilogex, Pechino, CinaS1010E
NaClSolarbio Life Science, Pechino, CinaS8210
NanPhotometer N50 TouchIMPLEN GMBH, GermaniaT51082
Purelab untra
RifampicinSolarbio Life Science, Pechino, CinaR8010
Scatola per piantine 30 * 200China
Thermal  Cycler  PCRBio-rad, oscillatoreT100
donglian Har lnstrument Manufacture Co., Ltd, CinaDLHE-Q200
Tomy AutoclaveTomy, GiapponeSX-500
TryptoneSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0042
UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA synthesis (con dsDNase)US Everbright INC, Jiangsu, CinaR2028
Estratto di lievito in polvereSolarbio Life Science, Pechino, CinaLP0021
CW3008M termostatico US Beijing

References

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