Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Summary

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Abstract

La scoperta di meccanismi che modellano i pergole dendritiche richiede metodi per visualizzare, immaginare e analizzare i dendriti durante lo sviluppo. La retina del topo è un potente sistema modello per lo studio dei meccanismi specifici del tipo cellulare della morfogenesi neuronale e della connettività. L'organizzazione e la composizione dei sottotipi di retina sono ben definite e sono disponibili strumenti genetici per accedere a tipi specifici durante lo sviluppo. Molti tipi di cellule retiniche vincolano anche i loro dendriti e / o assoni a strati stretti, il che facilita l'imaging time-lapse. Le colture di espianto della retina del topo sono adatte per l'imaging di cellule vive utilizzando la microscopia confocale o multifotonica, ma mancano metodi ottimizzati per l'imaging della dinamica della dendrite con risoluzione temporale e strutturale. Qui viene presentato un metodo per etichettare e visualizzare scarsamente lo sviluppo di specifiche popolazioni retiniche caratterizzate dal sistema Cre-Lox. I virus adeno-associati disponibili in commercio (AAV) qui utilizzati hanno espresso proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente. La somministrazione intraoculare di AAV nei topi neonatali produce l'etichettatura fluorescente dei tipi di cellule mirate entro 4-5 giorni dall'iniezione (dpi). I segnali fluorescenti a membrana sono rilevabili mediante imaging confocale e risolvono strutture e dinamiche di rami fini. Video di alta qualità della durata di 2-4 ore vengono acquisiti dall'imaging di supporti piatti retinici perfusi con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (aCSF). Viene inoltre fornita una pipeline di post-elaborazione delle immagini per la deconvoluzione e la correzione tridimensionale (3D) della deriva. Questo protocollo può essere utilizzato per catturare diversi comportamenti cellulari nella retina intatta e per identificare nuovi fattori che controllano la morfogenesi dei neuriti. Molte strategie di sviluppo apprese nella retina saranno rilevanti per comprendere la formazione di circuiti neurali altrove nel sistema nervoso centrale.

Introduction

I dendriti dei neuroni retinici formano schemi intricati, ma specifici, che influenzano la loro funzione all'interno dei circuiti neurali. Nella retina dei vertebrati, diversi tipi di cellule gangliari retiniche (RGC) e interneuroni a cellule amacrine portano morfologie dendritiche uniche che differiscono per dimensioni del pergolato, posizione, lunghezza del ramo e ^densità1. Durante lo sviluppo postnatale, gli RGC e le cellule amacrine estendono i processi dendritici esuberanti in un neuropil chiamato strato plessiforme interno (IPL), dove ricevono input di cellule bipolari che trasmettono segnali fotorecettori2. Come c....

Protocol

NOTA: Questo protocollo si estende su 2 giorni con un periodo minimo di 4-5 giorni per la trasduzione virale tra i giorni sperimentali (Figura 1A). Gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso degli animali nella ricerca e nella cura degli animali da laboratorio secondo protocolli approvati dal Laboratory of Animal Services Animal Use and Care Committee presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada).

1. Preparazioni per le iniezioni neonatali di AAV ed esperimenti di imaging

1. Selezionare una linea del mouse Cre per ....

Results

Utilizzando il protocollo di cui sopra, è stato acquisito, deconvoluto e corretto un video 3D ad alta risoluzione dello sviluppo di dendriti di cellule starburst. Sono state prodotte proiezioni massime del piano Z per realizzare video 2D per l'analisi (Video supplementare 1, Figura 5A). La deconvoluzione 3D di ogni punto temporale ha aumentato la risoluzione delle proiezioni di filopodi fini (Figura 5B, C). Le protrusioni sottil.......

Discussion

Questo video dimostra una pipeline sperimentale che utilizza gli strumenti genetici esistenti per visualizzare le dinamiche dendrite dello sviluppo di neuroni retinici con imaging vivo confocale. Sono state dimostrate anche iniezioni intraoculari di AAV Cre-dipendenti che codificano proteine fluorescenti mirate alla membrana nei topi neonatali. Le singole cellule di popolazioni geneticamente mirate sono marcate brillantemente già a 4-5 dpi. I supporti piatti retinici sono stati preparati per le camere di imaging standard.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene viral prep #45185-AAV9
Addgene viral prep #45186-AAV9
Strumenti di dissezione
Carta da filtro in cellulosa	Whatman	1001-070
Dumont #5 pinze fini	FST	11252-20	Due pinze Dumont #5 sono necessarie per la microdissezione retinica
Forbici sottili	Dumont VWR	82027-426
	FST	14058-09
Carte da filtro con membrana mista di estere di cellulosa (MCE), idrofile, 0,45 e micro; m dimensione dei pori	Millipore	HABG01 300
Piastra di Petri, 50 &volte; 15 mm	VWR	470313-352
Pipetta di trasferimento monouso in polietilene	VWR	470225-034
Pennello a punta tonda, misura 3/0	Negozio		Sono necessari due pennelli di misura 3/0 (o più piccoli) per le
forbici chirurgiche	retinico FST	14007-14
Forbici a molla Vannas - Tagliente da 2,5 mm	FST	15000-08
Live-imaging sistema di incubazione
Tubo in polietilene a camera, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
Controller riscaldatore a doppio canale, modello TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0,95 W Obiettivo a immersione	VISIR Leica	15506374
Cavo controller riscaldatore	Warner Instruments	CC-28
Grande camera di incubazione a bagno con supporto per fette	Warner	Instruments RC-27L
MPII Mini-Pompa peristaltica	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D Piattaforma riscaldata magnetica (riscaldatore della camera di incubazione)	Warner Instruments	PM-6D
Testa della pompa Pezzi di tubo per pompa mini-peristaltica MPII	Harvard Apparatus	55-4148
Ancoraggio per campioni (arpe)	Warner Instruments	64-0260	L'ancoraggio per campioni deve essere compatibile con la camera di incubazione
Sloflo Riscaldatore per soluzione in linea	Warner Instruments	SF-28
Iniezioni neonatali
10 µ Siringa da microlitro L serie 700, ago rimovibile	Hamilton Company	80314
Aghi ipodermici da 30 g (0,5 pollici)	BD PrecisionGlide	305106
capillare in vetro a parete sottile da 4 pollici, senza filamento (diametro esterno 1,0 mm/0,75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Etanolo 99,8% (da diluire al 70% con acqua bidistillata [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vector Core	AV-9-PV2453	Addgene Plasmide #45185
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vector Core	AV-9-PV2454	Addgene Plasmide #45186
ChAT-IRES-Cre knock-in linea di topi transgenici	The Jackson Laboratory	6410
Fast Green FCF Contenuto di colorante ≥ 85 %	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone, modello P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Pasta per tatuaggi verde	Ketchum MFG Co	329A
Soluzione salina tamponata con fosfato, pH 7,4, liquida, filtrata sterile, adatta per colture cellulari	Sigma-Aldrich	806552
Pneumatic PicoPump	WPI World Precision Instruments	PV-820
Liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (aCSF) Reagenti
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Carbogen (5% CO2, 95% O2)	AirGas	X02OX95C2003102	Il fornitore può variare a seconda della regione
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, acido libero	Bio Basic	HB0264
Soluzione di acido cloridrico, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2· 6H2O)	per pH Sigma-Aldrich	M2670
(6,0-7,7)	VWR	BDH35317.604
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Cloruro di sodio (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Fosfato di sodio monobasico (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	Open source