Articolo metodologico

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

DOI:

10.3791/62312

28 marzo 2021

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Abstract

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Introduzione

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Il glioblastoma (GBM) è il tipo più comune e aggressivo di tumore cerebrale primario. Attualmente, la sopravvivenza globale dei pazienti GBM che hanno ricevuto il massimo trattamento (una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia) è ancora inferiore a 15 mesi; quindi sono urgentemente necessarie terapie nuove ed efficaci per GBM.

La presenza di cellule staminali di glioma (GSC) nel GBM costituisce una sfida considerevole per il trattamento convenzionale in quanto queste cellule staminali svolgono ruoli di perno nel mantenimento del microambiente tumorale, della resistenza ai farmaci e della recidiva tumorale1. Pertanto, il targeting delle GSC potrebbe essere una strategia promettente per il trattamento GBM2. Tuttavia, un importante svantaggio per l'efficacia del farmaco in GBM è la sua natura eterogenetica, inclusa ma non limitata alla differenza di mutazioni genetiche, sottotipi misti, regolazione epigenetica e microambiente tumorale che li rende molto refrattari per il trattamento. Dopo molti studi clinici falliti, scienziati e ricercatori clinici si sono resi conto che la terapia mirata a singolo agente è probabilmente incapace di controllare completamente la progressione di tumori altamente eterogenei come il GBM. Considerando che, combinazioni di farmaci accuratamente selezionate sono state approvate per la loro efficacia migliorando sinergicamente l'effetto l'una dell'altra, fornendo così una soluzione promettente per il trattamento GBM.

Sebbene ci siano molti modi per valutare le interazioni farmaco-farmaco di una combinazione di farmaci, come i valori CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) e Bliss, ecc. 3,4, questi metodi dicalcolosono solitamente basati su combinazioni di concentrazione multiple. In effetti, questi metodi possono fornire una valutazione affermativa dell'interazione farmaco-farmaco, ma possono essere molto laboriosi se applicati nello screening ad alto rendimento. Per semplificare il processo, è stato sviluppato un flusso di lavoro di screening per identificare rapidamente le potenziali combinazioni di farmaci che inibiscono la crescita delle GSC originate da biopsie chirurgiche del paziente GBM. Un indice di sensibilità (SI) che riflette la differenza tra l'effetto combinato atteso e l'effetto combinato osservato è stato introdotto in questo metodo per quantificare l'effetto sinergizzante di ciascun farmaco, in modo che i potenziali candidati possano essere facilmente identificati dalla classifica SI. Nel frattempo, questo protocollo dimostra uno screening di esempio per identificare i potenziali candidati che possono sinergizzare l'effetto anti-glioma con temozolomide, la chemioterapia di prima linea per il trattamento GBM, tra 20 piccoli inibitori molecolari.

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Protocollo

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Il campione gbM è stato acquisito da un paziente durante un'operazione di routine dopo aver ottenuto il consenso pienamente informato dal comitato etico della ricerca umana del primo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Nanchino.

1. Isolamento e coltura delle GSC derivate dal paziente

  1. Posizionare il tessuto di glioblastoma fresco resecato chirurgicamente in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PBS sterile e conservare il tessuto sul ghiaccio fino a un'ulteriore operazione.
  2. Tritare il tessuto GBM in pezzi di diametro da 0,5 a 1 mm usando le forbici di dissezione e lavare i campioni di tessuto con un mezzo basale neuronale per rimuovere i detriti cellulari in un armadio di biosicurezza.
  3. Digerire i frammenti di tessuto con 1 mg/mL di collagenasi A a 37 °C per 30 minuti e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
  4. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con mezzo basale neuronale vuoto e dissociare meccanicamente il pellet mediante pipettaggio ripetitivo su ghiaccio.
  5. Colturare la miscela in piastre di coltura a 6 pozzetti ad attacco ultra-basso riempite con terreno di coltura GSC (vedere tabella 1 per la ricetta) in un incubatore cellulare sterile con il 5% di CO2 e il 90% di umidità a 37 °C fino alla formazione della neurosfera.
  6. Su sufficiente formazione della neurosfera, raccoglierli usando una pipetta in un microtubo da 1,5 ml e centrifuga a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  7. Risuscisci il pellet e dividilo in diversi palloni riempiti con il terreno di coltura di cui sopra per mantenere le GSC primarie.
    NOTA: le GSC derivate dal paziente utilizzate nell'esempio sono state derivate da biopsie chirurgiche di un paziente di sesso maschile di 34 anni con GBM ricorrente di grado IV dell'OMS. I GSC sono stati nominati come XG387 per gli esperimenti futuri. I test del micoplasma basati sulla PCR sono stati eseguiti per le GSC di cui sopra per confermare che non è presente alcuna contaminazione da micoplasma. Tutti gli esperimenti che coinvolgono le GSC utilizzate in questo protocollo sono stati condotti <15 passaggi.

2. Preparazione delle GSC con tag luciferasi

  1. Raccogliere le GSC dalla mediacoltura e centrifugarle a 70 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere il surnatante, digerire le cellule con l'accutasi per 4 minuti a 37 °C. Utilizzare ripetutamente una punta e una pipetta da 200 μL per dissociare e risusciare il pellet cellulare.
  3. Diluire le cellule a 2 x 105 cellule per pozzetti in una piastra di coltura a 12 pozzetti e farle in coltura durante la notte.
  4. Aggiungere 30 μL di surnatante del virus luciferasi-EGFP (titolo >108 TU /mL) in ciascun pozzo della piastra e quindi centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 ore a 25 °C. Coltura le cellule durante la notte.
  5. Aggiorna il mezzo il giorno successivo e coltivate le cellule per altre 48 ore.
  6. Osservare le cellule al microscopio fluorescente per confermare l'aspetto delle cellule GFP positive.
  7. Utilizzare un selezionatore di celle a flusso per ordinare e selezionare le GSC con elevata fluorescenza GFP per far coltura ulteriormente le cellule.

3. Misurazione della vitalità cellulare basata sulla bioluminescenza

  1. Piastre di rivestimento con la miscela a matrice extracellulare (ECM) (ad esempio, Matrigel): aggiungere 40 μL di miscela ECM da 0,15 mg/mL a ciascun pozzetti e incubare la piastra per 1 ora a 37 °C. Rimuovere la miscela ECM in eccesso e risciacquare delicatamente una volta con PBS.
  2. Aggiungere un terreno di coltura da 100 μL contenente 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 e 500 cellule XG387-Luc insieme a un mezzo vuoto da 100 μL come controllo in ciascun pozzetti per 6 repliche in una piastra inferiore ottica a 96 pozzetti e colturare le cellule durante la notte a 37 °C.
  3. Rimuovere il surnatante, aggiungere 50 μL di terreno di coltura contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
  4. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS. Utilizzare il software integrato per creare più aree circolari della regione di interesse (ROI) e quantificare la bioluminescenza cellulare.

4. Trattamento con Temozolomide e screening di combinazione

  1. Preverare quattro piastre da 96 pozzi come descritto sopra, prima del trattamento.
  2. Semina cellule XG387-Luc ad una densità di 1.000 cellule in un terreno di coltura da 100 μL in ciascun pozzetti di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltura le cellule durante la notte.
  3. Preparare in anticipo temozolomide e gli agenti mirati dalla soluzione stock. Preparare una serie di concentrazioni composta da 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM temozolomide in terreno di coltura per il trattamento con un singolo agente. Temozolomide diluito e gli agenti bersaglio in soluzione stock nel terreno di coltura, rispettivamente, per ottenere concentrazioni finali di 200 μM e 2 μM per lo screening farmacologico combinato (Tabella 2).
  4. Rimuovere il terreno di coltura quando la maggior parte delle GSC aderisce al fondo delle piastre; aggiungere il mezzo sopra preparato contenente temozolomide in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
  5. Per trattare Temozolomide e per esaminare le combinazioni di farmaci rimuovere il mezzo vuoto e aggiungere il mezzo sopra preparato contenente 200 μM temozolomide, o 2 μM agente mirato, o una combinazione di entrambi in ciascun pozzetto per tre repliche tecniche per trattamento.
  6. Incubare tutte le piastre a 37 °C, 5% CO2 per 3 giorni.
  7. Rimuovere il mezzo contenente il farmaco, aggiungere 50 μL di terreno bianco contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C.
  8. Scatta immagini della bioluminescenza cellulare nella piastra utilizzando il sistema di imaging dello spettro IVIS. Utilizza il software integrato per creare più ROI circolari e quantificare la bioluminescenza cellulare.

5. Trattamento combinato di temozolomide e UMI-77 in linee cellulari XG387-Luc e XG328-Luc

  1. Prevere tre piastre da 96 pozzi come descritto sopra, prima del trattamento.
  2. Semina cellule XG387-Luc e XG328-Luc ad una densità di 1.000 cellule rispettivamente in 100 μL di terreno di coltura in ciascun pozzetti di una piastra di fondo ottica a 96 pozzetti e coltura le cellule durante la notte.
  3. Preparare una serie di concentrazioni composta da 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM e 0 μM temozolomide e una serie di concentrazione composta da 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM e 0 μM UMI-77 nel terreno di coltura per trattamenti con matrice di titolazione a dose sei per sei.
  4. Rimuovere il supporto vuoto quando la maggior parte delle GSC aderisce al fondo della piastra; aggiungere il mezzo sopra preparato in ogni pozzo per tre repliche tecniche per trattamento.
  5. Incubare queste piastre per 3 giorni a 37 °C, 5% CO2.
  6. Rimuovere il mezzo contenente farmaci; aggiungere 50 μL di mezzo bianco contenente 150 ng/μL di D-luciferina in ciascun pozzo e incubare le cellule per 5 minuti a 37 °C per la misurazione della bioluminescenza.

6. Analisi dei dati

  1. Calcolare il punteggio dell'indice di sensibilità (SI) di temozolomide e agente mirato secondo la formula in Figura 2A.
    NOTA: Il punteggio SI è quello di quantificare l'influenza dell'aggiunta di un altro farmaco. Variava da -1 a +1, con valori positivi che indicavano effetti sinergici di temozolomide.
  2. Calcola i valori dell'indice di combinazione (CI) tra temozolomide e UMI-77 utilizzando il software CompuSyn per analizzare le loro interazioni combinate. Il valore CI <1 indica la sinergia; Il valore CI >1 indica l'antagonismo.
  3. Calcolare gli elevati valori di agente singolo (HSA) tra temozolomide e UMI-77 utilizzando il software Combenefit. Il valore HSA indica l'effetto inibitorio combinato. Il valore HSA >0 indica sinergia e il valore HSA <0 indica antagonismo.

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Risultati

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Le cellule XG387 hanno formato neurosfere nel terreno di coltura descritto nella Tabella 1 in una piastra di coltura a 6 pozzetti di attacco ultra-basso o in una piastra non rivestita5 (Figura 1A). In primo luogo, è stato eseguito un test per verificare se l'intensità di bioluminescenza delle cellule XG387-Luc fosse proporzionale al numero di cellule. Come mostrato in Figura 1B,l'intensità della bioluminescenza è aumentat...

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Discussione

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Nel presente studio, è stato descritto un protocollo che può essere applicato per identificare potenziali terapie di combinazione per GBM utilizzando GSC derivate dal paziente. A differenza del modello metrico standard di sinergia / additività come i metodi Loewe, BLISS o HSA, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplice e rapido che non richiede che una coppia di farmaci sia combinata a concentrazioni multiple in modo fattoriale completo come i metodi tradizionali. In questo flusso di lavoro, SI (indice di sensibilit...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti da divulgare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la National Natural Science Foundation of China (81672962), la Jiangsu Provincial Innovation Team Program Foundation e la Joint Key Project Foundation della Southeast University e della Nanjing Medical University per il loro sostegno.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
B-27Gibco17504-04450X
EGFGibcoPHG031320 ng/ml
FGFGibcoPHG026320 ng/ml
Gluta MaxGibco35050061100X
Gibconeurobasale211030491X
Penicillina-StreptomicinaHyCloneSV30010P: 10.000 unità/ml        S:  10.000 ug/ml
di Piruvato di sodioGibco2088876100 mM
Tabella 1. Il  formulazione  di GSC  Terreno di coltura completo.  
ABT-737MCESelettivo e BH3 mimetico Bcl-2,  Bcl-xL  e  Bcl-w  inibitore
Adavosertib (MK-1775)MCEWee1  inibitore
AxitinibMCEInibitore multi-target della tirosin-chinasi
AZD5991MCEMcl-1  inibitore
A 83-01MCEPotente inibitore del recettore TGF-β tipo I  ALK5 chinasi
CGP57380Selleckpotente MNK1  inibitore
Dactolisib (BEZ235)SelleckDual ATP-competitivo  PI3K  e  mTOR  inibitore
DasatinibMCEDual  Bcr-Abl e Src famiglia tirosin-chinasi inibitore
ErlotinibMCEEGFR  inibitore della tirosin-chinasi
GefitinibMCEEGFR tirosin-chinasi inibitore
LinifanibMCEInibitore multi-target di  VEGFR  e  PDGFR  famiglia
MasitinibMCEInibitore di  c-Kit
ML141SelleckInibitore non competitivo di  Cdc42 GTPase 
OSI-930MCEInibitore multi-target di Kit, KDR e CSF-1R 
PalbociclibMCEselettivo  CDK4  e  CDK6  inibitore
SB 202190MCEselettivo  p38 MAPPA chinasi  inibitore
Sepantronio bromuro (YM-155)MCESurvivin  inibitore
TCS 359SelleckPotente inibitore FLT3
UMI-77MCESelettivo  MCL-1  inibitore
4-idrossitamoxifene (afimoxifene)SelleckSelective  recettore degli estrogeni (ER)  modulatore
Tabella 2. Le informazioni di 20 agenti mirati utilizzati nella schermata di test. Tutti questi sono inibitori selettivi di piccole molecole. Il provider, il nome e le destinazioni sono stati forniti nella tabella.

Riferimenti

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  1. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  2. Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).
  3. Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
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  7. Jansen, V. M., et al. Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer. Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).
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Glioma Stem CellsCombination TherapyDrug ScreeningGlioblastoma TreatmentPatient Derived GSCsLuciferase TaggingMatrigel Coated PlatesFlow Cell SortingBioluminescence ImagingTargeted Agents

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