Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

Sommario

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Abstract

Le cellule staminali del glioma (GSC) sono una piccola frazione di cellule tumorali che svolgono ruoli essenziali nell'inizio del tumore, nell'angiogenesi e nella resistenza ai farmaci nel glioblastoma (GBM), il tumore cerebrale primario più diffuso e devastante. La presenza di GSC rende il GBM molto refrattario alla maggior parte dei singoli agenti mirati, quindi sono necessari metodi di screening ad alto rendimento per identificare potenziali terapie di combinazione efficaci. Il protocollo descrive un semplice flusso di lavoro per consentire uno screening rapido per la potenziale terapia di combinazione con interazione sinergica. I passaggi generali di questo flusso di lavoro consistono nello stabilire GSC con tag luciferasi, preparare piastre rivestite di matrigel, screening farmacologico combinato, analisi e convalida dei risultati.

Introduzione

Il glioblastoma (GBM) è il tipo più comune e aggressivo di tumore cerebrale primario. Attualmente, la sopravvivenza globale dei pazienti GBM che hanno ricevuto il massimo trattamento (una combinazione di chirurgia, chemioterapia e radioterapia) è ancora inferiore a 15 mesi; quindi sono urgentemente necessarie terapie nuove ed efficaci per GBM.

La presenza di cellule staminali di glioma (GSC) nel GBM costituisce una sfida considerevole per il trattamento convenzionale in quanto queste cellule staminali svolgono ruoli di perno nel mantenimento del microambiente tumorale, della resistenza ai farmaci e della recidiva tumorale^1....

Protocollo

Il campione gbM è stato acquisito da un paziente durante un'operazione di routine dopo aver ottenuto il consenso pienamente informato dal comitato etico della ricerca umana del primo ospedale affiliato dell'Università di Medicina di Nanchino.

1. Isolamento e coltura delle GSC derivate dal paziente

1. Posizionare il tessuto di glioblastoma fresco resecato chirurgicamente in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PBS sterile e conservare il tessuto sul ghiaccio fino a un'ulteriore operazione.
2. Tritare il tessuto GBM in pezzi di diametro da 0,5 a 1 mm usando le forbici di dissezione e lavare i campioni di tessuto con un me....

Risultati

Le cellule XG387 hanno formato neurosfere nel terreno di coltura descritto nella Tabella 1 in una piastra di coltura a 6 pozzetti di attacco ultra-basso o in una piastra non rivestita⁵ (Figura 1A). In primo luogo, è stato eseguito un test per verificare se l'intensità di bioluminescenza delle cellule XG387-Luc fosse proporzionale al numero di cellule. Come mostrato in Figura 1B,l'intensità della bioluminescenza è aumentat.......

Discussione

Nel presente studio, è stato descritto un protocollo che può essere applicato per identificare potenziali terapie di combinazione per GBM utilizzando GSC derivate dal paziente. A differenza del modello metrico standard di sinergia / additività come i metodi Loewe, BLISS o HSA, è stato utilizzato un flusso di lavoro semplice e rapido che non richiede che una coppia di farmaci sia combinata a concentrazioni multiple in modo fattoriale completo come i metodi tradizionali. In questo flusso di lavoro, SI (indice di sensibilit.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Gibco	neurobasale	21103049	1X
Penicillina-Streptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unità/ml        S:  10.000 ug/ml
di Piruvato di sodio	Gibco	2088876	100 mM
Tabella 1. Il  formulazione  di GSC  Terreno di coltura completo.
ABT-737	MCE		Selettivo e BH3 mimetico Bcl-2,  Bcl-xL  e  Bcl-w  inibitore
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1  inibitore
Axitinib	MCE		Inibitore multi-target della tirosin-chinasi
AZD5991	MCE		Mcl-1  inibitore
A 83-01	MCE		Potente inibitore del recettore TGF-β tipo I  ALK5 chinasi
CGP57380	Selleck		potente MNK1  inibitore
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitivo  PI3K  e  mTOR  inibitore
Dasatinib	MCE		Dual  Bcr-Abl e Src famiglia tirosin-chinasi inibitore
Erlotinib	MCE		EGFR  inibitore della tirosin-chinasi
Gefitinib	MCE		EGFR tirosin-chinasi inibitore
Linifanib	MCE		Inibitore multi-target di  VEGFR  e  PDGFR  famiglia
Masitinib	MCE		Inibitore di  c-Kit
ML141	Selleck		Inibitore non competitivo di  Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Inibitore multi-target di Kit, KDR e CSF-1R
Palbociclib	MCE		selettivo  CDK4  e  CDK6  inibitore
SB 202190	MCE		selettivo  p38 MAPPA chinasi  inibitore
Sepantronio bromuro (YM-155)	MCE		Survivin  inibitore
TCS 359	Selleck		Potente inibitore FLT3
UMI-77	MCE		Selettivo  MCL-1  inibitore
4-idrossitamoxifene (afimoxifene)	Selleck		Selective  recettore degli estrogeni (ER)  modulatore
Tabella 2. Le informazioni di 20 agenti mirati utilizzati nella schermata di test. Tutti questi sono inibitori selettivi di piccole molecole. Il provider, il nome e le destinazioni sono stati forniti nella tabella.