Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole

Summary

Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).

Abstract

Viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED). MicroED è stato sviluppato per risolvere strutture di proteine e piccole molecole utilizzando apparecchiature standard di criomicroscopia elettronica (crio-EM). In questo modo, piccole molecole, peptidi, proteine solubili e proteine di membrana sono state recentemente determinate ad alte risoluzioni. I protocolli sono presentati qui per la preparazione di griglie di farmaci a piccole molecole usando il farmaco carbamazepina come esempio. Vengono presentati protocolli per lo screening e la raccolta dei dati. Ulteriori passaggi nel processo complessivo, come l'integrazione dei dati, la determinazione della struttura e il perfezionamento, sono presentati altrove. Il tempo necessario per preparare le griglie di piccole molecole è stimato in meno di 30 minuti.

Introduction

La diffrazione elettronica a microcristalli (MicroED) è un metodo di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) per determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni sub-micrometriche ^1,2. I cristalli vengono applicati alle griglie standard del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e congelati immergendosi nell'etano liquido o nell'azoto liquido. Le griglie vengono quindi caricate in un TEM che opera a temperature criogeniche. I cristalli si trovano sulla griglia e vengono schermati per la qualità iniziale della diffrazione. I dati MicroED a rotazione continua vengono raccolti da un sot....

Protocol

1. Preparazione di campioni di piccole molecole

1. Trasferire una piccola quantità (0,01 - 1 mg) di polvere, liquido o solidi in un piccolo flaconcino o tubo.
2. Per i campioni già in polvere, sigillare il tubo usando il tappo fino a quando il campione è necessario. Essiccare i campioni liquidi in polveri prima di tentare di utilizzare il metodo 1 (fase 3) o 2 (fase 4).
   NOTA: i campioni disciolti nel liquido possono utilizzare il metodo 3 (5.X) riportato di seguito.

2. Preparazione delle reti TEM

NOTA: alcuni TEM con sistemi di caricamento automatico richiedono che le griglie vengano tagliate....

Results

MicroED è un metodo crioEM che sfrutta le forti interazioni tra elettroni e materia, che consente lo studio di cristalli^12,13 infinitamente piccoli. Dopo questi passaggi, ci si aspetta di avere un filmato di diffrazione in formato cristallografico raccolto da microcristalli (Filmato 1). Qui, la tecnica è dimostrata usando carbamazepina¹². I risultati mostrano un set di dati MicroED a rotazione continua da un microcristallo.......

Discussion

La preparazione dei campioni è in genere un processo iterativo, in cui le ottimizzazioni vengono effettuate dopo sessioni di screening e raccolta dati. Per i campioni di piccole molecole, è spesso prudente tentare prima la preparazione della griglia senza scaricare le griglie, poiché molti farmaci tendono ad essere idrofobici^10,11. Se le griglie hanno troppo pochi depositi nanocristallini, è una buona idea riprovare dopo aver scaricato le griglie. Può darsi che i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette Eppendorf da 0,1-1,5 ml	Fisher Scientific	14-282-300	Qualsiasi fiala o provetta andrà bene.
Clip a griglia automatica	Thermo-Fisher	1036173	Le griglie ritagliate non sono necessarie per MicroED. Sono necessari per i TEM Thermo-Fisher dotati di un sistema di caricamento automatico.
Autogrid C-ring	Thermo-Fisher 1036171
Carbamazapina	Sigma	C4024-1G	Qualsiasi quantità sarà sufficiente per questi esperimenti
Rivelatore basato su CMOS	Thermo-Fisher	CetaD 16M	Abbiamo usato un CetaD 16M, ma qualsiasi rivelatore con modalità rolling shutter o lettura sufficientemente veloce è accettabile.
Software Delphi	Thermo-Fisher	N/A	Software sui sistemi Thermo-Fisher TEM che consente la rotazione manuale dello stadio di campionamento
Software EPU-D	Thermo-Fisher	N/A	Software commerciale per l'acquisizione dei dati MicroED
Vetrini di copertura	Hampton	HR3-231
Scaricatore di incandescenza	Pelco	easiGlow
Pinzette ad alta precisione	EMS	78325-AC	Qualsiasi pinzetta ad alta precisione funzionerà Recipiente
azoto liquido	Spear Lab	FD-800	Un recipiente standard in schiuma per la manipolazione di campioni sotto azoto liquido - 800mL
Software SerialEM	UC Boulder	N/A Software	gratuito distribuito da D. Mastronarde. Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e dello Sviluppo
Le griglie TEM	Quantifoil/EMS	Q310CMA	Multi-A 300 mesh sono state utilizzate qui, ma qualsiasi griglia di carbonio sottile funzionerà. Per queste piccole molecole, suggeriamo di iniziare con il carbonio continuo.
microscopio elettronico a trasmissione	TEMähch-Fisher	Talos Arctica
Whatman carta da filtro circolare	Millipore-Sigma	WHA1001090	90 mm o superiore