Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.
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Articolo metodologico
Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ultimo decennio ha visto enormi progressi nella comprensione di piccole molecole di segnalazione nella fisiologia batterica. In particolare, le proteine bersaglio di diversi messaggeri secondari derivati da nucleotidi (NSM) sono state sistematicamente identificate e studiate in organismi modello. Questi risultati sono dovuti principalmente allo sviluppo di diverse nuove tecniche tra cui la tecnica del composto di cattura e l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando (DRaCALA), che sono state utilizzate per identificare sistematicamente le proteine bersaglio di queste piccole molecole. Questo documento descrive l'uso di NSM, guanosina penta- e tetrafosfati (p)ppGpp, come esempio e dimostrazione video della tecnica DRaCALA. Utilizzando DRaCALA, 9 su 20 note e 12 nuove proteine bersaglio di (p)ppGpp sono state identificate nell'organismo modello, Escherichia coli K-12, dimostrando la potenza di questo test. In linea di principio, DRaCALA potrebbe essere utilizzato per studiare piccoli ligandi che possono essere etichettati da isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. I passaggi critici, i pro e i contro di DRaCALA sono discussi qui per un'ulteriore applicazione di questa tecnica.
Introduzione
I batteri utilizzano diverse piccole molecole di segnalazione per adattarsi ad ambienti in costante cambiamento1,2. Ad esempio, gli autoindoduttori, i lattoni N-acilomoserina e i loro oligopeptidi modificati, mediano la comunicazione intercellulare tra i batteri per coordinare il comportamento della popolazione, un fenomeno noto come quorum sensing2. Un altro gruppo di piccole molecole di segnalazione sono gli NSM, tra cui l'adenosina monofosfato ciclico (cAMP), il di-AMP ciclico, il monofosfato ciclico di di-guanosina (di-GMP ciclico) e i guanosina penta- e tetra fosfati (p)p....
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Protocollo
1. Preparazione di lizzati a cellule intere
- Inoculare i ceppi di raccolta E. coli K-12 ASKA ORFeome15 in 1,5 mL di brodo di lisogenia (LB) contenente 25 μg/mL di cloramfenicolo in piastre di pozzetti profondi 96 pozzetti. Crescere durante la notte (O/N) per 18 ore a 30 °C con agitazione a 160 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere isopropil β-d-1-tiogalattosiranoside (IPTG) (0,5 mM finale) alle colture O/N per indurre l'espressione proteica a 30 °C per 6 ore.
- Celle a pellet a 500 x g per 10 min. Congelare il pellet a -80 °C fino all'uso. Per lisi delle cellule, aggiungere 150 μL di tampone di lisi L1 (4....
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Risultati
Seguendo il protocollo sopra descritto si produrranno in genere due tipi di risultati (Figura 3).
La Figura 3A mostra una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi (frazioni di legame < 0,025) dalla maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo dal pozzo H3 dà una frazione di legame di ~0,35 che è molto più alta di quella osservata per gli altri pozzi. Anche senza quantificazione, beh H3 è notevole, sugger.......
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Discussione
Uno dei passaggi critici nell'esecuzione dello screening DRaCALA è quello di ottenere buoni lasati a cellule intere. In primo luogo, le proteine testate dovrebbero essere prodotte in grandi quantità e in forme solubili. In secondo luogo, la lisi delle cellule dovrebbe essere completa e la viscosità del lizzate deve essere minima. L'inclusione del lisozima e l'uso di tre cicli di congelamento-disgelo sono spesso sufficienti per far lisi completamente le cellule. Tuttavia, il DNA cromosomico rilasciato rende viscoso il lis.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da divulgare.
Ringraziamenti
Il lavoro è supportato da una sovvenzione del progetto NNF (NNF19OC0058331) a YEZ e dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito della convenzione di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) a MLS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 32P-α-GTP | Perkinelmer | BLU006X250UC | |
| 96 x strumento a perno | V& P Scientific | VP 404 | 96 Bolt Replicator, su 9 mm di interasse, 4,2 mm di diametro del bullone, 24 mm di lunghezza |
| 96 pozzetti V-bottom | micropiastra Sterilin | MIC9004 | Sterilin Micropiastra V Well 611V96 |
| Agar | OXOID - Thermo Fisher | LP0011 | Agar n. 1 |
| ASKA collection ceppo | NBRP, SHIGEN, GIAPPONE | Rif: Ricerca sul DNA, Volume 12, Numero 5, 2005, Pagine 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012 | |
| Benzonase | SIGMA | E1014-25KU | endonucleasi geneticamente modificata da Serratia marcescens |
| Bradford Protein Assay Dye | Bio-Rad | 5000006 Reagent Concentrate | |
| DMSO | SIGMA | D8418 | ≥ 99,9% |
| DNasi 1 | SIGMA | DN25-1G | |
| filtrazione su gel colonna 10x300 | GE Healthcare | 28990944 | contiene il 20% di etanolo come conservante |
| Glicerolo | PanReac AppliChem | 122329.1214 | Glicerolo 87% per analisi |
| Ipercassetta | Amersham | RPN 11647 | 20 x 40 cm |
| Imidazolo | SIGMA | 56750 | puriss. ≥ 99,5% (GC) |
| Schermo al fosforo di archiviazione IP | FUJIFILM | 28956474 | BAS-MS 2040 20x 40 cm |
| Isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | SIGMA | I6758 | Isopropil β-D-tiogalattoside |
| Brodo di lisogenia (LB) | Invitrogen - Thermo Fisher | 12795027 | Miller's LB Brodo Base |
| Lisozima | SIGMA | L4949 | dall'albume d'uovo di gallina; BioUltra, polvere liofilizzata, ≥ 98% |
| MgCl2 (Cloruro di magnesio) | SIGMA | 208337 | |
| MilliQ acqua | ultrapura | ||
| Thermo Scientific | 4661110 | F1 - Clip Tip; 1-10 ul, 8 x canali | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810 | AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur. |
| Ni-NTA Agarosio | Qiagen | 30230 | |
| Membrana assorbente nitrocellulosica | Amersham Protran | 10600003 | Premium 0,45 um 300 mm x 4 m |
| PBS | OXOID - Thermo Fisher | BR0014G | Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco A), Compresse |
| PEG3350 (Polietilenglicole 3350) | SIGMA | 202444 | |
| Fenilmetilsulfonile fluoruro (PMSF) | SIGMA | 93482 | Soluzione di fluoruro di fenilmetanosulfonile - 0,1 M in etanolo (T) |
| Imager | GE Healthcare | 28955809 | Typhoon FLA-7000 Phosphor-imager |
| Puntali per pipette, filtrati | Thermo Scientific | 94410040 | ClipTip 12.5 μ l |
| colonna per cromatografia Poly-Prep | Colonna per cromatografia in polipropilene | Bio-Rad | 7311550 |
| Inibitore della proteasi Mini | Pierce | A32955 | senza EDTA |
| Provette per | 3488 | 2,0 ml con tappo a vite, non sterile | |
| SLS Piastre a 96 pozzetti profonde | Greiner | 780285 | MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, |
| colonna di centrifuga | Millipore | UFC500396 | Amicon Ultra -0,5 ml Filtri centrifughi |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | Thermomixer C |
| Piastra TLC (PEI-cellulosa F Piastre TLC) | Merck Millipore | 105579 | DC PEI-cellulosa F (20 x 20 cm) |
| Tris | SIGMA | BP152 | Tris Base per Biologia Molecolare |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | detergente viscoso non ionico |
| β-mercaptoetanolo | SIGMA | M3148 | 99% (GC/titolazione) |
Riferimenti
- Kalia, D., et al. Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis. Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).
- Camilli, A., Bassler, B. L. Bacterial small-molecule signali....
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Ristampe e permessi
