Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Steven G. Negron; Bing Xu; Zhiqiang Lin

doi:10.3791/62332

Articolo metodologico

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

DOI:

10.3791/62332

⸱

12 marzo 2021

Steven G. Negron¹ , Bing Xu¹ , Zhiqiang Lin¹

¹Masonic Medical Research Institute

In questo articolo

Sommario

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Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Abstract

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Il tessuto adiposo bruno (BAT) è responsabile della termogenesi senza brividi nei mammiferi e gli adipociti bruni (BA) sono le unità funzionali della BAT. I BA contengono sia goccioline lipidiche multiloculari che abbondanti mitocondri ed esprimono la proteina 1 disaccoppiante (UCP1). I BA sono classificati in due sottotipi in base alla loro origine: BA classici derivati da embrioni (cBA) e BAs derivati da adipociti bianchi. A causa della loro densità relativamente bassa, i BA non possono essere isolati dalle BAT con il metodo di centrifugazione tradizionale. In questo studio, è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA dai topi per l'analisi dell'espressione genica e proteica. In questo protocollo, il BAT interscapolare di topi adulti è stato digerito con la soluzione di collagenasi e dispasi e i BA dissociati sono stati arricchiti con una soluzione di iodixanolo al 6%. I BA isolati sono stati quindi lisati con il reagente Trizol per l'isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine. Dopo l'isolamento dell'RNA, la fase organica del lisato è stata utilizzata per l'estrazione delle proteine. I nostri dati hanno mostrato che la soluzione di iodixanolo al 6% ha arricchito efficacemente i BA senza interferire con gli studi di espressione genica e proteica di follow-up. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali. Rispetto al tessuto adiposo bruno, i BA isolati avevano un'espressione significativamente più elevata di Pdgfa. In sintesi, questo nuovo metodo fornisce una piattaforma per studiare la biologia degli adipociti bruni a livello di singola cellula.

Introduzione

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Sia i topi che gli esseri umani hanno due tipi di tessuto adiposo: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)¹. WAT immagazzina energia sotto forma di trigliceridi negli adipociti bianchi e gli adipociti bruni (BA) di BAT dissipano l'energia chimica come calore². In base alla loro origine evolutiva, i BA sono ulteriormente classificati in BA classici (cBA) che si sono formati durante lo sviluppo embrionale e BAs derivati da adipociti bianchi (cellule beige/brite, convertite da adipociti bianchi in condizioni di stress)³. I BA sono multiloculari ed esprimono la proteina termogena di....

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Protocollo

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Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre⁹ e Rosa 26^tdTomato topi linee¹³ sono state segnalate in precedenza. Tutti i topi sono stati tenuti a temperatura ambiente con un ciclo luce/buio di 12 ore.

1. Preparazione delle soluzioni e del tessuto adiposo bruno (BAT)

Preparare la soluzione di digestione e la soluzione di separazione in provette da centrifuga da 15 ml.
10 mL di soluzione di digestione BAT:....

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Risultati

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Preparazione di BAT interacapulare per l'isolamento degli adipociti bruni
Il processo di isolamento degli adipociti bruni (BA) è rappresentato nella Figura 1A. L'intero processo, dalla preparazione delle BAT e delle soluzioni di digestione/separazione all'ottenimento di BA isolati, richiederà circa 4 ore.

Nei topi adulti, esiste un'abbondante BAT nella regione interscapolare. Questo BAT interscapolare (iBAT) è coperto da strati muscolari e WAT .......

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Discussione

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In questo studio è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

In un protocollo di isolamento BAs pubblicato, la soluzione BSA al 3% è stata utilizzata per arricchire BAs¹². Tuttavia, i BA arricchiti ottenuti da questo protocollo pubblicato non potevano essere utilizzati direttamente per l'analisi dell'espressione proteica. Questo perché la BSA concentrata esistente nella soluzione di BA interferisce con l'estrazio.......

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Ringraziamenti

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Z. Lin è stato supportato dai fondi del National Institutes of Health HL138454-01 e del Masonic Medical Research Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Anticorpi
Antigenio	Azienda	Catalogo
PPARγ	LSBio	Ls-C368478
PDGFRa	Santa Cruz	sc-398206
UCP1	R& Sistema D	IC6158P
Chimica e soluzioni
Collagenasi, Tipo II	Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-cloropropano	Sigma-Aldrich	B62404
Albumina sierica bovina (BSA)	Goldbio	A-421-10
Cloruro di calcio	Bio Basic	CT1330
Cloroformio	IBI Scientific	IB05040
Dispasi II, proteasi	Sigma-Aldrich	D5693
EDTA	Bio Basic	EB0107
Etanolo	IBI Scientific	IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix	LifeSct	LS01131905Y
Cloruro di magnesio esaidrato	Boston BioProducts	P-855
OneScrip Plus sintesi di cDNA SuperMix	ABM	G454
OptiPrep (iodixanol)	Cosmo Bio USA	AXS-1114542
PBS (10x)	Caisson Labs	PBL07
PBS (1x)	Caisson Labs	PBL06
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23227
Cloruro di potassio	Boston BioProducts	P-1435
Tinta sicura SimplyBlue	Invitrogen	LC6060
Dodecil solfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	75746
Reagente Trizol	Tecnologie di vita	15596018
Primers
Nome del gene (Specie)	Avanti	inverso Pdgfra
(Mouse)	CTCAGCTGTCTCCTCACAgG	CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse)	TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG	TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse)	TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC	TCTCCAGAGACAATGCCAGGAC
Ucp1	ACTGCCACACCTCCAGTCATT	CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
strong>Equipment
Name	Azienda	Application
Keyence BZ-X700		Keyence Imaging adipociti
Agitatore magnetico	VWR	Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Sistema PCR in tempo reale	applicato Biosystem	PCR
L'Odissea Fc Sistema di imaging	LI-COR	Western blot immaging

<marroniquantitativa

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013)....

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Espressione genica isolamento cellulare arricchimento con iodixanolo digestione con collagenasi gel SDS PAGE gocce lipidiche multiloculari proteina disaccoppiante 1

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