Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Sia i topi che gli esseri umani hanno due tipi di tessuto adiposo: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)¹. WAT immagazzina energia sotto forma di trigliceridi negli adipociti bianchi e gli adipociti bruni (BA) di BAT dissipano l'energia chimica come calore². In base alla loro origine evolutiva, i BA sono ulteriormente classificati in BA classici (cBA) che si sono formati durante lo sviluppo embrionale e BAs derivati da adipociti bianchi (cellule beige/brite, convertite da adipociti bianchi in condizioni di stress)³. I BA sono multiloculari ed esprimono la proteina termogena disaccoppiante proteina 1 (UCP1)⁴. Il deposito interscapolare BAT (iBAT) è uno dei principali depositi di cBA nei piccoli mammiferi⁵, mentre le cellule beige sono disperse all'interno di WAT⁶.

A causa della loro natura di dissipazione di energia, i BA hanno ricevuto molta attenzione come obiettivo terapeutico per ridurre l'obesità⁷. Per sfruttare i BA allo scopo di trattare l'obesità, è essenziale comprendere i meccanismi molecolari che controllano la funzione, la sopravvivenza e il reclutamento dei BA. I tessuti adiposi tra cui BAT e WAT sono eterogenei. Ad eccezione degli adipociti, i tessuti adiposi contengono molti altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali, le cellule staminali mesenchimali e i macrofagi⁸. Sebbene siano disponibili strumenti genetici per esaurire specificamente i geni candidati nei BA dei topi, come UCP1::Cre linea⁹, le tecniche per purificare i BA da BAT o WAT sono limitate, rendendo difficile studiare i BA a livello di tipo di singola cellula. Inoltre, senza ottenere BA puri, la relazione tra BA e non BA non sarà chiaramente delineata. Ad esempio, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) è stato utilizzato come marker per le cellule mesenchimali indifferenziate ed è espresso nelle cellule endoteliali e interstiziali di BAT. Nelle BAT stressate a freddo, le cellule progenitrici PDGFRα positive danno origine a nuovi BA¹⁰. PDGFRα è attivato dal suo ligando PDGF, un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali¹¹; tuttavia, non è chiaro se i BA influenzino il comportamento delle cellule progenitrici PDGFRα positive secernendo PDGF.

Recentemente è stato pubblicato un protocollo di isolamento BAs, basato sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)¹². In questo protocollo, la soluzione di albumina sierica bovina al 3% (BSA) è stata utilizzata per separare i BA dai non BA e i BA arricchiti sono stati ulteriormente purificati da FACS. L'applicazione di questo protocollo è limitata dal requisito del processo FACS, che si basa sia sulle apparecchiature che sulle esperienze operative FACS. In questo studio è stato sviluppato un nuovo protocollo per isolare i BA dalle BAT. I BA isolati da questo protocollo possono essere utilizzati direttamente per studi di espressione genica e proteica. Inoltre, i dati di questo studio suggeriscono che i BA sono una delle principali risorse del PDGF.

Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre⁹ e Rosa 26^tdTomato topi linee¹³ sono state segnalate in precedenza. Tutti i topi sono stati tenuti a temperatura ambiente con un ciclo luce/buio di 12 ore.

1. Preparazione delle soluzioni e del tessuto adiposo bruno (BAT)

1. Preparare la soluzione di digestione e la soluzione di separazione in provette da centrifuga da 15 ml.
2. 10 mL di soluzione di digestione BAT: A 10 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), aggiungere 3,5 mg/mL di Dispase II, 1 mg/mL di collagenasi II e 10 mM di CaCl₂ per ottenere una soluzione di digestione BAT.
3. 10 mL di soluzione di iodixanolo al 12% (soluzione di separazione): Mescolare 1 mL di 10x PBS, 2 mL di iodixanolo al 60%, 0,01 mL di 1 M MgCl 2, 0,025 mL di 1 M KCl, 0,1 mL di acido etilendiamminotetraacetico 0,2 M (EDTA) e 6,865 mL di ddH₂O per ottenere il 12% di iodixanolo.
4. Eutanasia di un topo adulto con overdose di CO₂ . In breve, riempire la gabbia del topo con CO₂ al 100% ad un tasso di spostamento del 10-30% del volume della gabbia al minuto. 5 minuti dopo, confermare la morte controllando l'assenza di respirazione visibilmente.
5. Seziona l'animale e raccogli il pipistrello interscapolare. Rimuovere WAT e strati muscolari sotto un microscopio stereo.
6. Per avere una digestione sufficiente, tagliare ogni lobo BAT in ~ 3 mm³ parti e metterle in un matraccio pulito da 50 ml con una barra di agitazione metallica e una soluzione digestiva da 5 ml. Prima di iniziare la digestione, lasciare riposare sul ghiaccio il matraccio contenente BAT e tampone di digestione per 1 ora.
   NOTA: Nelle fasi seguenti, sono stati utilizzati circa 80 mg di BAT per l'isolamento degli adipociti bruni.

2. Procedura di isolamento dei BA

1. Posizionare il pallone su un agitatore magnetico racchiuso in un'incubatrice. Impostare la velocità di agitazione rispettivamente a 60 giri/min e la temperatura dell'incubatore a 35 °C. La digestione durerà circa 30 minuti. Se le fette BAT formano grumi attorno alla barra dell'agitatore durante la digestione, utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per interrompere i tessuti aggregati.
2. Posizionare un filtro filtrante da 70 μm sopra una provetta da centrifuga pulita da 50 ml. Pipettare intorno a 4 mL di sospensione cellulare attraverso il filtro. Lavare il colino con 4 ml di soluzione di iodixanolo al 12%. Pipettare su e giù per mescolare le cellule e la soluzione di iodixanolo. Trasferire la miscela cellulare in due provette di polistirene trasparente da 5 ml.
   NOTA: Alla fine della digestione, la soluzione di digestione dovrebbe essere torbida, indicando una digestione sufficiente. Utilizzare ogni volta una soluzione digestiva fresca. Una volta preparata, la soluzione di digestione deve essere utilizzata entro 2 ore.
3. Ripetere i passaggi 2.2 e 2.3 ancora una volta se la digestione non è sufficiente.
4. Lasciare i tubi di polistirene trasparente contenenti la soluzione di separazione e i BA sul ghiaccio per 1 ora. I BA formeranno uno strato sulla parte superiore.
5. Estrarre 20 μL dei BA isolati per l'esame al microscopio.

3. Isolamento di RNA e proteine da BA

1. Pipettare lo strato di BA in due provette da microcentrifuga da 1,7 mL per l'isolamento di RNA e proteine. Rimuovere con attenzione la soluzione di iodixanolo in eccesso senza interrompere lo strato di BA.
2. Aggiungere 1 mL di Trizol per isolare simultaneamente RNA, DNA e proteine nella soluzione cellulare. Mescolare a sufficienza per lisare le cellule.
3. Aggiungere 200 μL di cloroformio per separare le fasi.
4. Centrifugare il tubo per 9.981 x g per 10 minuti a 4 °C.
5. Dopo la centrifugazione, utilizzare la fase acquosa per l'isolamento dell'RNA. In questo studio, l'RNA totale è stato utilizzato per la trascrizione inversa e la RT-PCR quantitativa è stata effettuata con Real-Time PCR. Le sequenze di primer sono elencate nella tabella dei materiali.
6. Trasferire 300 μL della fase organica in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
7. Alla fase organica, aggiungere 2,5 volume 100% etanolo e vortice per 10 s.
8. Aggiungere 200 μL di 1-Bromo-3-cloropropano e vortice per 10 s.
9. Aggiungere 600 μL di acqua bidistillata e vortice per 10 s.
10. Lasciare riposare la soluzione miscelata per 10 minuti a temperatura ambiente.
11. Centrifugare a 9,981 x g per 10 minuti a 4 °C. In questa fase, le fasi saranno separate. La fase proteica è localizzata nello strato intermedio.
12. Rimuovere la soluzione acquosa superiore. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% nella soluzione rimanente.
13. Centrifugare per 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Dopo la centrifugazione, si formerà il pellet proteico. Scartare il surnatante.
14. Lavare il pellet con 1 mL 100% etanolo.
15. Centrifugare per 10 min, 9981 x g, 4 °C. Conservare il pellet e scartare il surnatante.
16. Asciugare all'aria il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente.
17. Misurare il peso del pellet bagnato. Aggiungere la soluzione SDS all'1% in un rapporto di 20 μL/mg di pellet.
18. Sciogliere il pellet mettendo il tubo in uno shaker riscaldato. Impostare la temperatura a 55 °C e la velocità a 11 x g. Di solito ci vogliono 5-10 minuti per sciogliere completamente il pellet proteico.
    NOTA: La concentrazione della proteina disciolta può essere misurata mediante il saggio BCA¹⁴.

Preparazione di BAT interacapulare per l'isolamento degli adipociti bruni
Il processo di isolamento degli adipociti bruni (BA) è rappresentato nella Figura 1A. L'intero processo, dalla preparazione delle BAT e delle soluzioni di digestione/separazione all'ottenimento di BA isolati, richiederà circa 4 ore.

Nei topi adulti, esiste un'abbondante BAT nella regione interscapolare. Questo BAT interscapolare (iBAT) è coperto da strati muscolari e WAT (Figura 1B). Prima di iniziare la procedura di digestione, gli strati muscolari e WAT devono essere rimossi per produrre iBAT pulito (Figura 1C). In un protocollo di isolamento BAs pubblicato, BAT tritato è stato utilizzato per l'isolamento BA12. In questo studio, la digestione di BAT di 3 mm3 (Figura 1D) ha prodotto più BA rispetto al BAT tritato.

Separazione di BA da non BA con soluzione BSA al 3%
Dopo la digestione di iBAT, i BA dissociati sono stati miscelati con non-BA nel prodotto della digestione. Poiché i BA contengono goccioline lipidiche, la loro densità è inferiore a quella dei non-BA; tuttavia, la densità dei BA non è abbastanza bassa da consentire loro di fluttuare in modo efficiente verso l'alto di una normale soluzione PBS. PBS contenente il 3% di albumina sierica bovina (BSA) è stato utilizzato per separare i BA dai non-BA12, che è stato ripetuto con successo in questo studio (Figura 2A).

Rosa 26 tdTomato è una linea di topi reporter, che esprime una forte proteina di fluorescenzatdTomato (tdTom ) dopo ricombinazione Cre-mediata13. I topi transgenici Ucp1::Cre esprimono Cre ricombinasi nei BA9. La linea del topo Ucp1::Cre è stata incrociata con i topi Rosa 26tdTomato per marcare geneticamente i BA con tdTom (Figura 2B). Per convalidare la procedura di isolamento dei BA, iBAT dai topi Ucp1::Cre;tdTom/+ è stato dissociato. La maggior parte delle cellule arricchite nello strato superiore della soluzione BSA erano a forma di lampone e contenevano goccioline lipidiche multiloculari. Inoltre, la maggior parte di queste cellule a forma di lampone erano tdTom positive (Figura 2C), confermando che erano adipociti bruni.

Separazione di BA da non-BA con soluzione di iodixanolo al 6%
La soluzione di separazione BSA al 3% ha arricchito i BA. Non era chiaro se questi BA isolati potessero essere utilizzati per l'analisi dell'espressione genica e proteica. RNA e proteine sono stati quindi estratti dai BA arricchiti. L'estrazione dell'RNA è stata eseguita con successo secondo la procedura standard di isolamento dell'RNA. Tuttavia, il protocollo standard di isolamento della proteina Trizol, noto anche come metodo guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio (metodo GTPC), non ha funzionato bene, il che era noioso e aveva una resa proteica molto bassa. Pertanto, è stato adottato un metodo migliorato di isolamento proteico per estrarre proteine da BA trizol-lisati.

In questo protocollo GTPC migliorato, etanolo, bromo-cloropropano e acqua sono stati utilizzati per estrarre proteine dalla fase organica15. Dopo aver aggiunto etanolo, bromo-cloropropano e acqua nella fase organica e dopo la centrifugazione, si è formato un pellet proteico tra la fase acquosa e la fase organica (Figura 3A). Il pellet proteico è stato quindi lavato con etanolo al 100% e sciolto in SDS all'1%. Questo metodo GTPC migliorato è stato utilizzato per estrarre proteine da BA arricchite in soluzione iBAT e BSA. Sebbene il pellet proteico BAT fosse facilmente disciolto in SDS all'1%, la maggior parte del pellet proteico di BA isolato non era solubile. Quindi la proteina disciolta è stata esaminata con il gel SDS-PAGE. Come mostrato in un gel SDS-PAGE colorato di blu di Coomassie (Figura 3B), una massiccia banda proteica di circa 60 kDa era presente nei BA isolati ma non nei campioni di BAT. Poiché il peso molecolare della BSA è di 66 kDa, e l'abbondante BSA esiste nella soluzione di separazione dei BA, questa banda proteica dominante dovrebbe essere BSA. Questi dati suggeriscono che la BSA dalla soluzione di separazione dei BA interferisce con l'estrazione delle proteine.

Lo iodixanolo è un mezzo a gradiente non ionico e iso-osmotico16 che è stato ampiamente utilizzato per la purificazione delle cellule17 e dei virus adeno-associati (AAV)18. Per evitare l'interferenza della BSA negli studi di espressione proteica, lo iodixanolo è stato utilizzato per sostituire BSA in una nuova soluzione di separazione dei BA. La soluzione BSA al 3% ha una densità di 1,03, che è simile allo iodixanolo al 6%. Nella soluzione di iodixanolo al 6%, i BA fluttuavano verso l'alto in 30-60 minuti (Figura 3C). I BA isolati con questa soluzione mostravano la tipica forma del lampone e contenevano goccioline lipidiche multiloculari (Figura 3D). Le proteine estratte da questi BA isolati sono state ben separate in gel SDS-PAGE (Figura 3E).

Per verificare se la soluzione di iodixanolo al 6% separasse efficacemente i BA dai non BA, abbiamo etichettato geneticamente i BA con tdTom ed esaminato le cellule che risiedono nella soluzione limpida di iodixanolo al 6%. Dopo aver separato i BA dai non-BA (fase 2.4), la soluzione di iodixanolo al 6% sotto lo strato di BA è stata diluita 6 volte con PBS ed è stata quindi centrifugata a 600 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, sul fondo si è formato un piccolo pellet di globuli rossi, che potrebbe essere costituito da cellule della frazione vascolare stromale. Come mostrato nella Figura 3, le cellule dello strato BA erano cellule tdTom positive (Figura 3F); tuttavia, le cellule recuperate dal pellet erano tdTom negative (Figura 3G). Inoltre, non erano visibili goccioline lipidiche evidenti nelle cellule tdTom negative. Questi dati suggeriscono che il nostro nuovo protocollo può separare in modo efficiente i BA dalle cellule non adipose.

Insieme, questi dati dimostrano che l'isolamento dei BA con una soluzione di BSA al 3% interferisce con gli studi biochimici di follow-up e suggerisce che la soluzione di iodixanolo al 6% è migliore della soluzione BSA al 3% per isolare i BA.

Analisi dell'espressione genica e proteica con BA isolati.
Per convalidare questa nuova procedura di isolamento dei BA a livello molecolare, è stata confrontata l'espressione di tre geni tra BAT e BA isolati: Ucp1, Pdgfa e Pdgfra. Nella BAT, Pdgfra è espresso nelle cellule endoteliali e nelle cellule interstiziali e nelle cellule interstiziali e le cellule PDGFRα positive sono cellule progenitrici putative10. I livelli di mRNA di Ucp1 e Pdgfa erano entrambi significativamente più alti nei BA isolati rispetto ai BAT (Figura 4A,B). Al contrario, l'mRNA di Pdgfra è stato rilevato solo in BAT (Figura 4B).

PPARγ è un fattore trascrizionale che controlla lo sviluppo del tessuto adiposo, UCP1 è una proteina dei mitocondri e PDGFRα è una proteina del recettore di membrana. Queste tre proteine rappresentano proteine distribuite in diversi compartimenti cellulari. Sono stati eseguiti Western blot per verificare se la proteina estratta da BA trizolo-lisati e BAT fosse adatta per l'analisi dell'espressione proteica. UCP1 e PPARγ sono stati rilevati sia nei BA che nei BAT (Figura 4C,D), confermando che la proteina totale isolata dai BA trizol-lisati o BAT è adatta per il western blot. Inoltre, coerentemente con i risultati della qRT-PCR, la proteina UCP1 è stata arricchita in BA (Figura 4C); mentre PDGFRα è stato rilevato solo nelle BAT ma non nei BA puri (Figura 4D). In sintesi, questi dati dimostrano che il nostro nuovo metodo di isolamento dei BA è efficiente e suggeriscono che i BA arricchiti da questo metodo possono essere utilizzati direttamente per studi di espressione genica e proteica.

Figura 1: Preparazione di iBAT per l'isolamento degli adipociti bruni. (A) Flusso di lavoro della procedura di isolamento degli adipociti bruni. (B) Vista ventrale del tessuto interscapolare contenente BAT, WAT e strati muscolari. (C) BAT interscapolare (iBAT). Gli strati muscolari e WAT adiacenti all'iBAT sono stati rimossi. (D) Un'immagine rappresentativa dei pezzi di iBAT utilizzati per l'isolamento degli adipociti bruni. B-D, Barra della scala = 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Separazione degli adipociti bruni dalla soluzione di digestione. (A) Immagini di adipociti bruni dissociati prima e dopo la separazione. La soluzione di BSA al 3% è stata utilizzata per separare gli adipociti bruni dagli adipociti non bruni. Barra della scala = 1 cm. (B) Vista schematica dell'etichettatura genetica degli adipociti bruni con proteina di fluorescenza tdTomato. (C) Immagini di adipociti bruni isolati. DIC, contrasto di interferenza differenziale. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Estrazione della proteina totale dagli adipociti bruni lisati . (A) Separazione della fase proteica dalla fase organica. (B) Colorazione Coomassie del gel SDS-PAGE. La proteina totale è stata estratta da adipociti bruni purificati con BAT o soluzione BSA al 3%. La banda proteica BSA era indicata da una freccia. (C) Strato di adipociti bruni formato sopra la soluzione di iodixanolo al 6%. Barra della scala = 1 cm. (D) Adipociti bruni isolati con soluzione di iodixanolo al 6%. Gli adipociti marroni erano indicati da frecce gialle. Barra della scala = 50 μm. (E) Colorazione Coomassie del gel SDS-PAGE. La proteina totale è stata estratta da BAT o BA arricchiti con soluzione di iodixanolo al 6%. (F) Immagini di adipociti marroni marcati con tdTom. (G) Immagini di cellule recuperate dalla soluzione di iodixanolo al di sotto dello strato di BAs. F e G, barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'espressione genica e proteica di adipociti bruni isolati. In questi studi di espressione genica e proteica sono stati utilizzati adipociti bruni isolati con il metodo iodixanolo. (A,B) qRT-PCR misurazione dell'espressione genica. I livelli di mRNA sono stati normalizzati a 36B4. N=3. Prova t dello studente, *, P<0.01; **, P<0.01. (C) Western blotting di PPARγ e UCP1. (D) Western blotting di PDGFRα. C e D, la membrana Ponceau colorata a S è stata utilizzata come controllo del carico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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