Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle tridimensionale semplificato e indifferenziato utilizzando una piattaforma microfluidica microlavorazione. Un approccio a flusso parallelo consente la deposizione in situ di un compartimento dermico per la semina di cellule epiteliali sulla parte superiore, il tutto controllato da pompe a siringa.

Abstract

Questo lavoro presenta una piattaforma microfluidica nuova, economica e affidabile con il potenziale per generare tessuti multistrato complessi. Come prova di concetto, è stata modellata una pelle umana semplificata e indifferenziata contenente un compartimento dermico (stromale) e un compartimento epidermico (epiteliale). Per raggiungere questo obiettivo, è stato sviluppato un dispositivo versatile e robusto, a base di vinile diviso in due camere, superando alcuni degli inconvenienti presenti nei dispositivi microfluidici a base di polidimetilsilossano (PDMS) per applicazioni biomediche, come l'uso di apparecchiature costose e specializzate o l'assorbimento di piccole molecole e proteine idrofobiche. Inoltre, è stato sviluppato un nuovo metodo basato sul flusso parallelo, che consente la deposizione in situ di entrambi i compartimenti dermico ed epidermico. Il costrutto cutaneo è costituito da una matrice di fibrina contenente fibroblasti primari umani e un monostrato di cheratinociti immortalizzati seminati sulla parte superiore, che viene successivamente mantenuto in condizioni di coltura dinamiche. Questa nuova piattaforma microfluidica apre la possibilità di modellare le malattie della pelle umana ed estrapolare il metodo per generare altri tessuti complessi.

Introduction

Recentemente, sono stati compiuti progressi verso lo sviluppo e la produzione di modelli in vitro di pelle umana per l'analisi della tossicità dei prodotti cosmetici e farmaceutici¹. I ricercatori nelle industrie farmaceutiche e della cura della pelle hanno utilizzato animali, i topi sono i più comuni, per testare i loro prodotti^2,3,4,5. Tuttavia, la sperimentazione di prodotti sugli animali non è sempre predittiva della risposta nell'uomo, che spesso porta a fallimento del farmaco o effetti avversi nell'uomo....

Protocol

1. Progettazione del chip e parametri di microlavorazione

1. Progettare gli strati di chip microfluidici con il software di progettazione open source FreeCAD; fare riferimento alla Tabella 1 per le dimensioni dei canali. Includere quattro fori di diametro di 2,54 mm nel progetto per utilizzare un allineatore personalizzato per una corretta sovrapposizione dello strato.

	Lunghezza (μm)	Larghezza (μm)
Camera inferiore	28,400	800
Camera super....

Results

Il chip progettato è composto da due camere fluidiche separate da una membrana PC di 5 μm di dimensioni dei pori che consente la crescita della cellula consentendo il passaggio di molecole che promuovono la crescita dalla camera inferiore. La camera superiore contiene il costrutto tissutale, in questo caso, un monostrato di hKCs su un idrogel di fibrina contenente hFB.

L'altezza dei canali è determinata dal numero di fogli adesivi aggiunti a ciascun canale. La camera inferiore è composta da 4 .......

Discussion

La motivazione per sviluppare questo metodo è stato il desiderio di modellare le malattie della pelle e studiare gli effetti di terapie nuove e innovative in una piattaforma ad alto rendimento. Ad oggi, questo laboratorio produce questi equivalenti dermo-epidermici colando - manualmente o con l'aiuto della tecnologia di bioprinting 3D - il gel di fibrina con fibroblasti in una piastra di inserto per colture cellulari e seminando i cheratinociti sopra di esso. Una volta che i cheratinociti raggiungono la confluenza, la co.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Acido tranexamico
Antibiotico/antimicotico	Thermo Scientific HyClone
Cloruro di calcio	Sigma Aldrich
Piastre di coltura	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Nastro biadesivo in vinile	ATP Sistemi adesivi		GM 107CC, 12 & micro; m di spessore
Plotter Edge	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Estratto da plasma umano
	Vetrino Thermo Scientific
GFP-Fibroblasti dermici umani-Primario			. Dono della Dott.ssa Marta Garcí una
linea cellulare H2B-GFP-HaCaT	ATCC		Cheratinociti immortalizzati. Dono della Dott.ssa Marta Garcí un
kit Live/dead	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Membrana in policarbonato	Merk TM		5 µ m dimensione dei pori
Polidimetilsilossano	Dow Corning		Sylgard 184
Cloruro di sodio	Sigma Aldrich
Siringhe	Terumo		5 mL
Trombina	Sigma Aldrich		10 NIH/fiala
Vinile adesivo trasparente	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 &; m di spessore
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16" OD, 0,020" Id