Qui descritto è un protocollo di estrazione del DNA che utilizza perline magnetiche per produrre estrazioni di DNA di alta qualità dalle zanzare. Queste estrazioni sono adatte per un approccio di sequenziamento di nuova generazione a valle.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un protocollo di estrazione del DNA delle zanzare a base di perline magnetiche per il sequenziamento di nuova generazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un protocollo di estrazione del DNA recentemente pubblicato che utilizza perline magnetiche e uno strumento automatizzato di estrazione del DNA hanno suggerito che è possibile estrarre DNA di alta qualità e quantità da una zanzara individuale ben conservata sufficiente per il sequenziamento dell'intero genoma a valle. Tuttavia, la dipendenza da un costoso strumento automatizzato di estrazione del DNA può essere proibitiva per molti laboratori. Qui, lo studio fornisce un protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche budget-friendly, adatto per una produttività da bassa a media. Il protocollo qui descritto è stato testato con successo utilizzando singoli campioni di zanzare Aedes aegypti. La riduzione dei costi associati all'estrazione del DNA di alta qualità aumenterà l'applicazione del sequenziamento ad alta produttività a laboratori e studi limitati alle risorse.
Introduzione
Il recente sviluppo di un protocollo di estrazione del DNAmigliorato 1 ha permesso molti studi a valle ad alto impatto che coinvolgono il sequenziamento dell'interogenoma 2,3,4,5,6. Questo protocollo di estrazione del DNA basato su perline magnetiche fornisce una resa affidabile del DNA da singoli campioni di zanzara, che a sua volta riduce il costo e il tempo associati all'acquisizione di un numero sufficiente di campioni dalle raccolte sul campo.
I recen....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Conservazione generale del campione e preparati prima dell'estrazione del DNA
- Idratare il campione in acqua pcr da 100 μL per 1 h (o durante la notte) a 4 °C se il campione è stato conservato in alcool >70% per ammorbidire il tessuto.
2. Interruzione del campione
- Impostare un incubatore o un blocco termico a tremante a 56 °C.
- Fare proteinasi K (PK) tampone/enzima miscela. Per ogni singola estrazione di zanzare sono necessari 2 μL di Proteinasi K (100 mg/mL) e 98 μL di Proteinasi K Buffer (totale 100 μL). Per preparare un mix master per più campioni, aumentare la quantità totale (combinata per tutti i s....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La resa media del DNA per singolo tessuto testa di zanzara/torace era di 4,121 ng/μL (N = 92, deviazione standard 3.513) misurata utilizzando un fluorometro se eluita utilizzando 100 μL di tampone di eluizione. Questo è sufficiente per i requisiti di input di DNA genomico da 10-30 ng necessari per la costruzione dell'intera libreriadel genoma 1,7. La quantità di DNA può variare tra 0,3-29,7 ng / μL a seconda delle dimensioni del corpo della zanzara e delle condiz.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il protocollo qui descritto può essere adattato per altre specie di insetti. La versione originale del protocollo introdotto in Nieman etal. An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta e Keiferia lycopersicella2,8,9,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il sostegno finanziario del Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases finanziato dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (Accordo di cooperazione 1U01CK000516), sovvenzione CDC NU50CK000420-04-04, l'USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch project 1025565), la borsa di studio UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory a Tse-Yu Chen, la sovvenzione NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030) e il Florida Department of Health (Contract CODQJ). I risultati e le conclusioni di questo articolo sono quelli dell'autore o degli autori e non rappresentano necessariamente le opinion....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AE Buffer | Qiagen | 19077 | Tampone di eluizione |
| AL Buffer | Qiagen | 19075 | Tampone di lisi |
| AW1 Buffer | Qiagen | 19081 | Tampone di lavaggio 1 |
| AW2 Buffer | Qiagen | 19072 | Tampone di lavaggio 2 |
| MagAttract Suspension G | Qiagen | 1026901 | cordone magnetico |
| Separatore di microsfere magnetico | Epigentek | Q10002-1 | |
| Spettrofotometro per microvolumi | Nanodrop | ThermoFisher ND-2000 | |
| PK Buffer ThermoFisher | 4489111 | Proteinasi K tampone | |
| Proteinasi K | ThermoFisher | A25561 | |
| Qubit | Invitrogen | Q33238 | fluorimetro |
Riferimenti
- Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
- Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in Califo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
