Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio l'uso di un sistema di riscaldamento a temperatura controllata a retroazione per promuovere l'assemblaggio monostrato lipidico e la formazione di bistrati di interfaccia a goccia per lipidi con temperature di fusione elevate e misurazioni della capacità per caratterizzare i cambiamenti guidati dalla temperatura nella membrana.

Abstract

Il metodo di battiscopi di interfaccia a goccia (DIB) per assemblare bistrati lipidici (cioè DIB) tra goccioline acquose rivestite di lipidi nell'olio offre vantaggi chiave rispetto ad altri metodi: i DIB sono stabili e spesso di lunga durata, l'area bistrato può essere sintonizzata in modo reversibile, l'asimmetria del foglio illustrativo è prontamente controllata tramite composizioni di goccioline e reti tissutali di bistrati possono essere ottenute confinando con molte goccioline. La formazione di DIB richiede l'assemblaggio spontaneo di lipidi in monostrati lipidici ad alta densità sulle superfici delle goccioline. Mentre questo si verifica prontamente a temperatura ambiente per i comuni lipidi sintetici, un monostrato o un bistrato stabile sufficiente non riesce a formarsi in condizioni simili per i lipidi con punti di fusione sopra la temperatura ambiente, inclusi alcuni estratti lipidici cellulari. Questo comportamento ha probabilmente limitato le composizioni - e forse la rilevanza biologica - dei DIB negli studi di membrana modello. Per affrontare questo problema, viene presentato un protocollo sperimentale per riscaldare attentamente il serbatoio dell'olio che ospita goccioline DIB e caratterizzare gli effetti della temperatura sulla membrana lipidica. In particolare, questo protocollo mostra come utilizzare un apparecchio in alluminio termoduttivo e elementi riscaldanti resistivi controllati da un circuito di feedback per prescrivere temperature elevate, che migliora l'assemblaggio monostrato e la formazione di due livelli per un set più ampio di tipi di lipidi. Le caratteristiche strutturali della membrana, così come le transizioni di fase termotropiche dei lipidi che compongono il bistrato, sono quantificate misurando i cambiamenti nella capacità elettrica del DIB. Insieme, questa procedura può aiutare a valutare i fenomeni biofisici nelle membrane modello a varie temperature, compresa la determinazione di una temperatura di fusione efficace(T_M)per miscele lipidiche multicomponente. Questa capacità consentirà quindi una più stretta replicazione delle transizioni di fase naturali nelle membrane modello e incoraggerà la formazione e l'uso di membrane modello da una fascia più ampia di costituenti della membrana, compresi quelli che catturano meglio l'eterogeneità delle loro controparti cellulari.

Introduction

Le membrane cellulari sono barriere selettivamente permeabili composte da migliaia di tipi lipidici^1,proteine, carboidrati e steroli che incapsulano e suddividono tutte le cellule viventi. Comprendere come le loro composizioni influenzano le loro funzioni e rivelare come le molecole naturali e sintetiche interagiscono, aderiscono, interrompono e traslocano le membrane cellulari sono, quindi, importanti aree di ricerca con implicazioni di vasta portata in biologia, medicina, chimica, fisica e ingegneria dei materiali.

Questi obiettivi di scoperta beneficiano direttamente di tecniche comprovate per assemblare, manipola....

Protocol

1. Preparazione dell'apparecchio riscaldato

1. Raccogliere 2 pezzi di gomma isolante spessa 1 mm tagliati a 25 mm x 40 mm di larghezza e lunghezza, rispettivamente, 2 pezzi di gomma spessa 6 mm che sono anche 25 mm x 40 mm, un gruppo di fissaggio di base in alluminio preparato e un serbatoio di olio acrilico che si adatta alla finestra di visualizzazione dell'apparecchio di base in alluminio (vedi figure S1, S2 e S3 per i dettagli sulla fabbricazione e una vista esplosa del gruppo). Preparare prima l'apparecchio in alluminio attaccando alla parte inferiore dell'apparecchio una finestra panoramica in vetro con adesivo polimerizzabile UV e aderen....

Results

La figura 1 mostra come l'apparecchio in alluminio e il serbatoio dell'olio acrilico sono preparati sullo stadio del microscopio per la formazione di DIB. I passaggi di assemblaggio 1.2-1.4 servono a isolare termicamente l'apparecchio dal palco per un riscaldamento più efficiente. I passaggi 1.5-1.7 mostrano come collegare correttamente la termocopia all'apparecchio e posizionare il serbatoio dell'olio, e i passaggi 1.8 -1.9 mostrano le posizioni consigliate per l'erogazione dell'olio in que.......

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per assemblare e far funzionare un sistema sperimentale per controllare la temperatura dell'olio e delle goccioline utilizzate per formare DIB. È particolarmente utile per consentire la formazione di DIB utilizzando lipidi che hanno temperature di fusione superiori a RT. Inoltre, variando con precisione la temperatura del serbatoio dell'olio, la temperatura del bistrato può essere manipolata per studiare gli effetti di temperature elevate su varie proprietà e caratteristich.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm di gomma isolante (x2)	Qualsiasi		Isola la parte inferiore del dispositivo di alluminio dal tavolino del microscopio
25 mm x 40 mm x 6 mm di gomma isolante (x2)	Qualsiasi		Protegge gli elementi riscaldanti dai danni causati dalle clip del tavolino del microscopio e isola la parte superiore degli elementi riscaldanti.
Acido 3-(N-morfolino) propansolfonico	Sigma Aldrich	M3183	Agente tampone per soluzione lipidica
Substrato acrilico	Fabbricato in casa	HTD_STG_2	~ 1000 uL pozzo acrilico con un profilo esterno poka-yoke per fissare l'orientamento
Apparecchio in alluminio	Fabbricato in casa	HTD_STG_1	Dispositivo di base con un pozzo di petrolio che contiene l'apparecchio acilico e include due cuscinetti piatti adiacenti al pozzo di petrolio per gli elementi riscaldanti...
Estratto di lipidi totali per il cervello	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL estratto di lipidi suini
Chassis DAQ compatto (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis per alloggiare diversi tipi di moduli di misura o di uscita del sensore
Sistema di acquisizione dati (DAQ)	Dispositivi molecolari	Digidata 1440A	Convertitore analogico/digitale ad alta risoluzione
Amplificatore/alimentatore a guadagno fisso	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifica l'uscita di tensione CC dal modulo di uscita
in tensione Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Sigilla il fondo della base in alluminio e consente la caratterizzazione ottica del doppio strato
Elemento riscaldante (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm in film di poliammide kapton con un limite di potenza di 5 watt.
Vite in acciaio inossidabile M3	McMaster Carr	90116A150	Fissa la termocoppia all'amplificatore
	in alluminio Molecular Devices	AxoPatch 200B	Misura la corrente e la tensione di uscita all'headstage
Personal computer	Qualsiasi		Computer con più porte usb ad alta velocità e un minimo di 6 Gb di ram
Cloruro di Potassio	Sigma Aldrich	P3911	Soluzione elettrolitica di ioni dissociati
Modulo di ingresso di temperatura	Instruments	NI 9211	Abilita misure di termocoppie a giunzione aperta e fredda per lo chassis cDAQ
Termocoppia	Omega	JMTSS-020U-6	Termocoppia di tipo U con un diametro di 0,02 pollici e 6 pollici di lunghezza
Adesivo polimerizzabile UV	Loctite	19739	Fissa il vetrino coprioggetto al dispositivo di base in alluminio
Modulo di uscita di tensione	National Instruments	NI 9263	Modulo di output di tensione analogico da utilizzare con lo chassis cDAQ
Generatore di forme d'onda	Agilent	33210A	Utilizzato per emettere una forma d'onda sinusoidale da 10 mV 10 Hz