Articolo metodologico

Imaging tridimensionale di organoidi per studiare la ciliogenesi primaria durante l'organogenesi ex vivo

DOI:

10.3791/62365

⸱

14 maggio 2021

 ,  ,  , 
1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes), 2CRBM, CNRS, University Montpellier, 3CRCINA, INSERM, CNRS, Université d’Angers, Université de Nantes

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi derivati da cellule staminali facilitano l'analisi dei processi molecolari e cellulari che regolano l'autorinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali durante l'organogenesi nei tessuti dei mammiferi. Qui presentiamo un protocollo per l'analisi della biologia del cilio primario in organoidi mammari di topo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi sono strutture tridimensionali derivate da cellule staminali che riproducono ex vivo la complessa architettura e fisiologia degli organi. Pertanto, gli organoidi rappresentano modelli utili per studiare i meccanismi che controllano l'auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali nei mammiferi, tra cui la ciliogenesi primaria e la segnalazione ciliare. La ciliogenesi primaria è il processo dinamico di assemblaggio del cilio primario, un centro di segnalazione cellulare chiave che controlla l'autorinnovamento e/o la differenziazione delle cellule staminali in vari tessuti. Qui presentiamo un protocollo completo per la colorazione in immunofluorescenza di marcatori di linee cellulari e ciglia primarie, in organoidi mammari di topo a montaggio intero, per la microscopia a foglio ottico. Descriviamo il metodo di imaging al microscopio e una tecnica di elaborazione delle immagini per l'analisi quantitativa dell'assemblaggio e della lunghezza del cilio primario negli organoidi. Questo protocollo consente un'analisi precisa delle ciglia primarie in strutture tridimensionali complesse a livello di singola cellula. Questo metodo è applicabile per la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging delle ciglia primarie e della segnalazione ciliare in organoidi mammari derivati da cellule staminali normali e geneticamente modificate, da tessuti sani e patologici, per studiare la biologia del cilio primario in salute e malattia.

Introduzione

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Lo sviluppo di organismi pluricellulari e il mantenimento dell'omeostasi nei loro tessuti adulti risiedono in una regolazione fine tra l'autorinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali, che orchestrano nel tempo e nello spazio il normale sviluppo e rigenerazione dei tessuti1. La sovversione di questa regola causa anomalie dello sviluppo e tumori2. Pertanto, la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari che orchestrano l'autorinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali è di fondamentale interesse nella biologia dello sviluppo e del cancro.

Il recente sviluppo di metodi di organogenesi ex vivo, in cui le cellule staminali tissutali generano organoidi tridimensionali, ha trasformato le nostre capacità di studiare la dinamica delle cellule staminali durante l'organogenesi dei mammiferi e il mantenimento dell'omeostasi tissutale in un piatto3. Gli organoidi rappresentano una buona alternativa ai ingombranti modelli animali geneticamente modificati per studiare questi processi. Sono stati ora sviluppati protocolli per lo sviluppo di organoidi da cellule staminali tissutalidi molti organi3, tra cui intestino tenue e colon, stomaco, fegato, pancreas, prostata e ghiandola mammaria3. Inoltre, lo sviluppo di tecniche somatiche di editing del genoma nelle cellule staminali che formano organoidi consente ora di interrogare rapidamente i meccanismi molecolari e cellulari che controllano la loro biologia 4,5.

Il cilio primario è una struttura a base di microtubuli assemblata sulla superficie delle cellule staminali e/o differenziate di vari tessuti6. È generalmente non mobile ed è assemblato come una singola struttura per cella7. La ciliogenesi primaria è il processo dinamico di assemblaggio del cilioprimario 7. Sulla superficie cellulare, il cilio funge da piattaforma di segnalazione cellulare8. Pertanto, si ritiene che il cilio primario agisca come regolatore chiave dell'autorinnovamento e/o della differenziazione delle cellule staminali in molti tessuti, tra cui il cervello 9,10, la ghiandola mammaria 4,11, il tessuto adiposo12 e l'epitelio olfattivo13, tra gli altri. La ciliogenesi primaria e/o la segnalazione ciliare sono regolate dinamicamente in linee cellulari distinte e in diversi stadi di sviluppo 4,13,14, ma i meccanismi sottostanti devono ancora essere ampiamente determinati.

L'organogenesi ex vivo si dimostra promettente per lo sviluppo di conoscenze di base sui meccanismi molecolari e cellulari che controllano la biologia delle cellule staminali, tra cui la ciliogenesi primaria e la segnalazione ciliare. Tuttavia, si basa sulla capacità di visualizzare correttamente gli organoidi dell'intera montatura a livello di singola cellula e su scala subcellulare. Recentemente abbiamo utilizzato un modello di organoide derivato da cellule staminali mammarie di topo per dimostrare che le ciglia primarie controllano positivamente la capacità di formazione di organoidi di cellule staminali mammarie di topo4. Qui presentiamo un protocollo completo per la colorazione in immunofluorescenza di organoidi mammari di topo a montatura intera (Figura 1A, B), che consente l'analisi delle ciglia primarie attraverso la microscopia a foglio di luce durante l'organogenesi ex vivo in tridimensionale. Recentemente sono stati pubblicati metodi alternativi per la colorazione in immunofluorescenza e l'imaging di organoidi mediante microscopia confocale15,16. Questo protocollo si concentra invece sulla preparazione e l'imaging di organoidi attraverso la microscopia a foglio di luce.

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Protocollo

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NOTA: Il protocollo seguente è raccomandato per la colorazione di organoidi che sono stati coltivati in 5 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e raggruppati insieme (> 100 organoidi). Gli organoidi sono stati derivati da cellule staminali mammarie di topo. I topi donatori sono stati alloggiati e gestiti in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Rennes (Francia).

1. Reagenti

  1. Per preparare la soluzione fissativa, diluire 125 μL di soluzione acquosa commerciale di paraformaldeide al 16% (PFA) in 375 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per generare una soluzione di PFA al 4%.
    ATTENZIONE: Manipolare il PFA che è una sostanza tossica sotto una cappa chimica.
  2. Per preparare il tampone di permeabilizzazione, diluire 1,5 μL di Triton X100 in 500 μL di PBS, per produrre una soluzione di Triton X100 allo 0,3%.
  3. Per preparare il tampone bloccante, diluire 1,5 μL di Tween-20 e 75 μL di siero di capra normale in PBS, per generare una soluzione di siero di capra al 5% e 0,1% di Tween 20.
  4. Per preparare il mezzo di montaggio del foglio leggero, sciogliere 1 g di agarosio ultrapuro a basso punto di fusione in 100 mL di dH20 o PBS a 65 °C. Preparare aliquote da 1 mL e conservare a temperatura ambiente.

2. Recupero degli organoidi

  1. Trasferire gli organoidi dai pozzetti di coltura a una provetta da 1,7 ml in polimero a basso legante, dopo averli pipettati su e giù 3 volte nei pozzetti, con una punta rivestita in FBS per la quale è stata tagliata l'estremità (diametro minimo dell'estremità 1,5 mm).
    NOTA: Il rivestimento impedisce agli organoidi di attaccarsi alla punta. Il materiale polimerico a basso legame consente di ridurre l'adesione degli organoidi al lato del tubo durante l'intera procedura di colorazione.
  2. Riempire il tubo con PBS e centrifugare a 350 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante.

3. Fissazione, permeabilizzazione e blocco

  1. Risospendere gli organoidi in 500 μl di PFA al 4%. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante.
    NOTA: Da questo passaggio in poi, risospendere gli organoidi nei diversi tamponi semplicemente aggiungendo i tamponi sul pellet di organoidi senza toccarli. Eseguire tutte le fasi di lavaggio a temperatura ambiente.
  2. Lavare gli organoidi con 1 mL di PBS per 3 min. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante.
    PAUSA: Gli organoidi fissi possono essere conservati in PBS a 4 °C per almeno una settimana.
  3. Permeabilizzare gli organoidi risospendendoli in 500 μL di PBS-Triton X100 0,3% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare gli organoidi a 350 g per 30 s.
  4. Lavare gli organoidi risospendendoli con 1 mL di PBS e incubare per 3 min. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante. Ripeti una volta.
  5. Opzionale: risospendere gli organoidi in 500 μl di metanolo ghiacciato. Incubare a - 20 °C per 10 min. Questo passaggio può essere necessario per la colorazione di specifici marcatori centrosomici.
  6. Facoltativo (se è stato eseguito il passaggio 5): Lavare gli organoidi con 1 mL di PBS per 3 minuti. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante. Ripeti una volta.
  7. Bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici negli organoidi risospendendoli con 500 μL di tampone bloccante (PBS, 5% siero di capra, 0,1% Tween 20). Incubare 1 ora e 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 350 g per 30 s. Rimuovere il surnatante.
  8. Lavare gli organoidi risospendendoli con 1 mL di PBS e incubare per 3 min. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante.

4. Etichettatura

  1. Risospendere gli organoidi con 200 μL di tampone bloccante con anticorpi primari diluiti e incubare per una notte a 4 °C con un leggero agitamento (60 giri/min su un agitatore orizzontale). Posizionare i tubi con un angolo di 45° con il piano orizzontale dello shaker. Manterrà gli organoidi sul fondo delle provette nel tampone di colorazione.
  2. Lavare gli organoidi risospendendoli con 1 mL di PBS e incubare per 5 min. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante. Ripeti due volte.
    NOTA: Alcuni organoidi nell'ultima fase possono attaccarsi al lato della provetta, con conseguente perdita di organoidi durante l'aspirazione del surnatante dopo la centrifugazione, l'aggiunta dello 0,2% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) al PBS nelle fasi di lavaggio può ridurre la perdita di organoidi.
  3. Risospendere gli organoidi con 200 μL di tampone bloccante con anticorpi secondari e incubare per 1 ora e 30 minuti con un leggero agitamento (60 giri/min su un agitatore orizzontale). Posizionare i tubi con un angolo di 45° con il piano orizzontale dello shaker. Manterrà gli organoidi sul fondo delle provette nel tampone di colorazione.
    NOTA: Hoechst (o altri coloranti nucleari, come DAPI o DRAQ5) possono essere aggiunti al tampone con anticorpi secondari.
  4. Lavare gli organoidi risospendendoli con 1 mL di PBS e incubare per 5 min. Centrifugare a 350 x g per 30 s. Rimuovere il surnatante. Ripeti due volte.
    NOTA: Alcuni organoidi nell'ultima fase possono attaccarsi al lato della provetta, con conseguente perdita di organoidi durante l'aspirazione del surnatante dopo la centrifugazione, l'aggiunta dello 0,2% (p/v) di BSA al PBS nelle fasi di lavaggio può ridurre la perdita di organoidi.

5. Preparazione del campione di agarosio per l'imaging

  1. Fondere il terreno di montaggio del foglio leggero incubandolo a 65 °C. Una volta che il terreno si è sciolto, incubarlo a 37 °C per 5 minuti.
  2. Risospendere gli organoidi in 100 μl di terreno di montaggio utilizzando un puntale da 200 μl, con l'estremità del puntale tagliata (dimensione minima dell'estremità: 1,5 mm), pipettando su e giù due volte.
  3. Aspirare il mezzo di montaggio con gli organoidi in un capillare di vetro (capillare verde, diametro interno: 1,5 mm) utilizzando uno stantuffo. Incubare il capillare a temperatura ambiente per 5 minuti affinché il mezzo di montaggio si solidifichi.
    PAUSA: Il capillare può essere conservato in PBS a 4 °C per una settimana prima dell'imaging.

6. Imaging

  1. Utilizzando un microscopio a foglio ottico (ad es. ZEISS Lightsheet Z.1), è possibile visualizzare gli organoidi con obiettivi a immersione in acqua 20x o 40x.
    1. Posizionare il capillare di vetro nella camera di osservazione. Localizzare il capillare con la fotocamera frontale e posizionare la punta del capillare di vetro al limite superiore dell'obiettivo di rilevamento.
    2. Selezionare il campione e impostare la messa a fuoco ottimale utilizzando la punta del capillare di vetro in illuminazione a campo chiaro. Estrarre lentamente il campione di agarosio dal capillare e individuare gli organoidi all'interno dell'agarosio solidificato.
    3. Conservare gli organoidi da visualizzare vicino alla punta del capillare, per ridurre i movimenti del campione di agarosio nel PBS. Ruotare il capillare per impostare l'orientamento ottimale del campione e definire lo zoom desiderato.
    4. Selezionare la modalità di acquisizione. Definire i canali per l'immagine, impostare l'orientamento corretto del foglio luminoso, impostare la potenza del laser per ciascun canale (per ridurre il fotosbiancamento, utilizzare una bassa potenza del laser), impostare la dimensione dell'immagine e il lato o i lati di illuminazione desiderati. Esempio di parametri di imaging: Dimensioni dell'immagine 1920 x 1920, illuminazione: doppio lato.
    5. Definisci lo Z-stack per l'immagine impostando le estremità Z dello stack utilizzando il modulo Z-stack e imposta la dimensione del passo Z su ottimale.
  2. Elaborare il file di output utilizzando il modulo di elaborazione delle immagini del software del microscopio per navigare nel campione, ottenere una proiezione Z e una rappresentazione 3D.
  3. Girare il campione e acquisire una nuova immagine da un'angolazione diversa o acquisire immagini di altri organoidi.
  4. Analizzare le immagini con un software di analisi delle immagini al microscopio interattivo (es. Imaris) che consente (i) la visualizzazione del campione in 3D (ii) la segmentazione degli oggetti (iii) l'identificazione e l'analisi quantitativa degli oggetti.

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Risultati

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I metodi di organogenesi ex vivo stanno trasformando le nostre capacità di studiare lo sviluppo dei tessuti dei mammiferi e il mantenimento dell'omeostasi dei tessuti in un piatto. L'analisi dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano questi processi, tra cui la ciliogenesi primaria e la segnalazione ciliare, si basa sulla capacità di visualizzare gli organoidi in tre dimensioni.

Il protocollo sopra descritto consente la colorazione di organoidi mammari a montatura intera. Deri...

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Discussione

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Il protocollo dettagliato qui presentato consente la colorazione e l'imaging di organoidi mammari di topo che crescono in terreno semisolido. Questo protocollo è presumibilmente applicabile alla colorazione di organoidi che imitano l'architettura di vari tessuti che crescono in mezzi semisolidi e solidi. Per gli organoidi che crescono in Matrigel al 100% con il terreno in cima, le fasi di recupero e fissazione differiscono leggermente. Il terreno di coltura deve essere rimosso dal pozzet...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Xavier Pinson per l'aiuto nello sviluppo della microscopia a foglio di luce; il centro biotecnologico Biosit, che comprende MRic, Arche, le strutture principali per la citometria a flusso e SFR Santé F. Bonamy, inclusa la struttura centrale MicroPICell, per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France. M.D. è stato sostenuto da una borsa di studio per laureati dell'Università di Rennes. V.J.G. è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato della Fondation ARC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-topo IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anti-topo IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anti-coniglio 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% Paraformaldeide Soluzione acquosa, EM Grade ElectronMicroscopy Sciences15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrin a6Biolegend313616
Light Sheet CapillaryZeiss701908
Light Sheet stantuffoZeiss701998
Bassa legatura Provette per microcentrifugaBioScience27210
Soluzione di blocco del siero di capra normaleLaboratori vettorialiS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
di segnalazione cellulareSlug9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
Termo-Fisher diAgarosio a Basso Punto di Fusione16520050
Tecnologia UltraPure

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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