Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

Summary

Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.

Abstract

Le specie di micobatteri possono differire l'una dall'altra nel tasso di crescita, nella presenza di pigmentazione, nella morfologia della colonia visualizzata su mezzi solidi e in altre caratteristiche fenotipiche. Tuttavia, tutti hanno in comune il carattere più rilevante dei micobatteri: la sua parete cellulare unica e altamente idrofoba. Le specie di micobatteri contengono un complesso legato alla membrana-covalente che include arabinogalattano, peptidoglicano e lunghe catene di acidi micolici con tipi che differiscono tra le specie di micobatteri. Inoltre, i micobatteri possono anche produrre lipidi che si trovano, non legati covalentemente, sulle loro superfici cellulari, come i dimicoceroti di policomerosati (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), glicopeptidolipidi (GPL), acilmalosi (AT) o mannosidi fosfatidi-inositolo (PIM), tra gli altri. Alcuni di essi sono considerati fattori di virulenza nei micobatteri patogeni o lipidi antigenici critici nell'interazione ospite-micobatteri. Per questi motivi, c'è un notevole interesse nello studio dei lipidi micobatterici a causa della loro applicazione in diversi campi, dalla comprensione del loro ruolo nella patogenicità delle infezioni da micobatteri, a una possibile implicazione come agenti immunomodulatori per il trattamento di malattie infettive e altre patologie come il cancro. Qui, viene presentato un semplice approccio per estrarre e analizzare il contenuto lipidico totale e la composizione dell'acido micolico delle cellule di micobatteri coltivate in un mezzo solido utilizzando miscele di solventi organici. Una volta ottenuti gli estratti lipidici, viene eseguita la cromatografia a strato sottile (TLC) per monitorare i composti estratti. L'esperimento di esempio viene eseguito con quattro diversi micobatteri: il Mycolicibacterium brumae e il Mycolicibacterium fortuitum a crescita lenta attenuati, il Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) a crescita rapida e il patogeno opportunistico a crescita rapida Mycobacterium abscessus, dimostrando che i metodi mostrati nel presente protocollo possono essere utilizzati per una vasta gamma di micobatteri.

Introduction

Mycobacterium è un genere che comprende specie patogene e non patogene, caratterizzate dall'avere una parete cellulare altamente idrofoba e impermeabile formata dai loro peculiari lipidi. In particolare, la parete cellulare micobatterica contiene acidi micolici, che sono acidi grassi α-alchilici e β-idrossi, in cui il ramo α è costante in tutti gli acidi micolici (ad eccezione della lunghezza) e la catena β, chiamata catena meromicolato, è una lunga catena alifatica che può contenere diversi gruppi chimici funzionali descritti insieme alla letteratura (α-, α'-, metossi-, κ-, epossidici, carbossi e ω-1-metossi-micolati), producendo quindi sette tipi di acidi ....

Protocol

1. Estrazione dei lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (Figura 1)

1. Graffiare 0,2 g di micobatteri da un mezzo solido e aggiungere a un tubo di vetro con tappi a vite in politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere una soluzione composta da 5 ml di cloroformio e 10 ml di metanolo (cloroformio:metanolo, 1:2).
   NOTA: quando si cioè abituati solventi organici, deve essere utilizzato solo il recipiente di vetro. Non sono ammessi contenitori di plastica. Inoltre, sono necessari tappi a vite in PTFE per bottiglie.
   ATTENZIONE: Il cloroformio è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere ....

Results

Con l'obiettivo di mostrare una vasta gamma di lipidi presenti in diverse specie di micobatteri, M. bovis BCG è stato selezionato in quanto è un micobatteri ruvido e a crescita lenta. Nella procedura sono stati aggiunti M. fortuitum e M. brumae ruvidi e a crescita rapida e, infine, è stato incluso anche il morfotipo liscio di M. abscessus. Queste quattro specie ci permettono di visualizzare un ampio spettro di lipidi derivati da micobatteri come acilmalosi (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, T.......

Discussion

Viene presentato un semplice protocollo considerato come il metodo gold standard per l'estrazione di composti lipidici non legati in modo covalente dalla parete cellulare micobatterica. Viene mostrata un'ulteriore visualizzazione da parte di TLC mono e bidimensionali dai lipidi estratti di quattro diversi micobatteri.

Due miscele combinate consecutive di cloroformio e metanolo per recuperare il contenuto lipidico delle cellule micobatteriche è la miscela solvente più utilizzata

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido acetico	Merck	100063	ATTENZIONE. Anidro per analisi EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Acetone	Carlo Erba	400971N	ATTENZIONE. ACETONE RPE-ACS-ISO PER ANALISI ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone per sintesi.
Benzene	Carlo Erba	426113	ATTENZIONE. Benzene RPE - Per analisi - ACS 2,5 l
Tubo capillare in vetro	Merck	BR708709	BRAND®   usa e getta BLAUBRAND®   micropipette, intraMark
Cloroformio	Carlo Erba	412653	ATTENZIONE. Cloroformio RS - Per HPLC - Grado isocratico - Stabilizzato con etanolo 2,5 L
Riscaldatore a blocco secco	J.P. Selecta	7471200
Diclorometano	Carlo Erba	412622	ATTENZIONE. Diclorometano RS - Per HPLC - Grado isocratico - Stabilizzato con amilene 2,5 L
Etere dietilico	Carlo Erba	412672	ATTENZIONE. Etere etilico RS - Per HPLC - Grado isocratico - Panreac in acetato di etile da 2,5 L non stabilizzato
		1313181211	ATTENZIONE. L'acetato di etile (Reag. USP, Ph. Eur.) per l'analisi, ACS, Assoluta di
Alcool Etilico	Carlo Erba	4146072	ATTENZIONE. Etanolo anidro assoluto RPE - Per analisi - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Imbuto in vetro	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
Tubo in vetro	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	Tubo in vetro con tappo recuperato in PTFE
Metanolo	Carlo Erba	412722	ATTENZIONE. Metanolo RS - Per HPLC - ORO - Acido
molibdatofosforico	Merck	51429-74-4	ATTENZIONE.
Reagente spray blu di molibdeno, 1,3%	Sigma	M1942-100ML	ATTENZIONE.
n-esano	Carlo Erba	446903	ATTENZIONE. n-Esano 99% RS - ATRASOL - Per analisi di tracce 2,5 L
n-nitroso-n-metilurea	Sigma	N4766	ATTENZIONE
Piattaforma di agitazione orbitale	DDBiolab	995018	NB-205L incubatore di agitazione da banco
Etere di petrolio (60-80º C)	Carlo Erba	427003	ATTENZIONE. Etere di petrolio 60 - 80 gradi C RPE - Per analisi Spruzzatore da 2,5 L
	VidraFOC	712/1
Solfato di sodio anidro	Merck	238597
Acido solforico 95-97%	Merck	1007311000	ATTENZIONE. Acido solforico 95-97%
TLC camera	Merck	Z204226-1EA	Serbatoi di sviluppo TLC rettangolari, completi L & H &volte; L 22 cm & 22 cm & tempi; Piastra TLC da 10 cm
	Merck	1057210001	TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
Riscaldatore a piastre TLC	CAMAG	223306	CAMAG Riscaldatore a piastre TLC III
Toluene	Carlo Erba	488551	ATTENZIONE. Toluene RPE - Per analisi - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex	Fisher Scientific	10132562	IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftolo	Sigma-Aldrich	102269427	ATTENZIONE.