Articolo metodologico

Analisi della composizione lipidica dei micobatteri mediante cromatografia a strato sottile

DOI:

10.3791/62368

⸱

16 aprile 2021

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le specie di micobatteri possono differire l'una dall'altra nel tasso di crescita, nella presenza di pigmentazione, nella morfologia della colonia visualizzata su mezzi solidi e in altre caratteristiche fenotipiche. Tuttavia, tutti hanno in comune il carattere più rilevante dei micobatteri: la sua parete cellulare unica e altamente idrofoba. Le specie di micobatteri contengono un complesso legato alla membrana-covalente che include arabinogalattano, peptidoglicano e lunghe catene di acidi micolici con tipi che differiscono tra le specie di micobatteri. Inoltre, i micobatteri possono anche produrre lipidi che si trovano, non legati covalentemente, sulle loro superfici cellulari, come i dimicoceroti di policomerosati (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), glicopeptidolipidi (GPL), acilmalosi (AT) o mannosidi fosfatidi-inositolo (PIM), tra gli altri. Alcuni di essi sono considerati fattori di virulenza nei micobatteri patogeni o lipidi antigenici critici nell'interazione ospite-micobatteri. Per questi motivi, c'è un notevole interesse nello studio dei lipidi micobatterici a causa della loro applicazione in diversi campi, dalla comprensione del loro ruolo nella patogenicità delle infezioni da micobatteri, a una possibile implicazione come agenti immunomodulatori per il trattamento di malattie infettive e altre patologie come il cancro. Qui, viene presentato un semplice approccio per estrarre e analizzare il contenuto lipidico totale e la composizione dell'acido micolico delle cellule di micobatteri coltivate in un mezzo solido utilizzando miscele di solventi organici. Una volta ottenuti gli estratti lipidici, viene eseguita la cromatografia a strato sottile (TLC) per monitorare i composti estratti. L'esperimento di esempio viene eseguito con quattro diversi micobatteri: il Mycolicibacterium brumae e il Mycolicibacterium fortuitum a crescita lenta attenuati, il Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) a crescita rapida e il patogeno opportunistico a crescita rapida Mycobacterium abscessus, dimostrando che i metodi mostrati nel presente protocollo possono essere utilizzati per una vasta gamma di micobatteri.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium è un genere che comprende specie patogene e non patogene, caratterizzate dall'avere una parete cellulare altamente idrofoba e impermeabile formata dai loro peculiari lipidi. In particolare, la parete cellulare micobatterica contiene acidi micolici, che sono acidi grassi α-alchilici e β-idrossi, in cui il ramo α è costante in tutti gli acidi micolici (ad eccezione della lunghezza) e la catena β, chiamata catena meromicolato, è una lunga catena alifatica che può contenere diversi gruppi chimici funzionali descritti insieme alla letteratura (α-, α'-, metossi-, κ-, epossidici, carbossi e ω-1-metossi-micolati), producendo quindi sette tipi di acidi micolici (I-VII)1. Inoltre, altri lipidi di indiscutibile importanza sono presenti anche nella parete cellulare delle specie di micobatteri. Specie patogene come Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi2 producono specifici fattori di virulenza a base lipidica come i dimicoceroti di polimicoceroti (PDIM), glicolipidi fenolici (PGL), di-, tri- e penta-acilmalefalosi (DAT, TAT e PAT), o sulfolipidi, tra gli altri3. La loro presenza sulla superficie micobatterica è stata associata alla capacità di modificare la risposta immunitaria dell'ospite e, quindi, all'evoluzione e alla persistenza del micobatterio all'interno dell'ospite4. Ad esempio, la presenza di triacilgliceroli (TAG) è stata associata al fenotipo ipervirulento del lignaggio 2-Pechino del lignaggio di M. tuberculosis, forse a causa della sua capacità di attenuare la risposta immunitaria dell'ospite5,6. Altri lipidi rilevanti sono i lipooligosaccaridi (LOS) presenti nei micobatteri tubercolari e non tubercolari. Nel caso di Mycobacterium marinum, la presenza di LOS nella sua parete cellulare è correlata alla motilità scorrevole e alla capacità di formare biofilm e interferisce con il riconoscimento da parte dei recettori di riconoscimento del pattern macrofagico, influenzando l'assorbimento e l'eliminazione dei batteri da parte dei fagociti ospiti7,8. Inoltre, l'assenza o la presenza di alcuni lipidi consente ai membri della stessa specie di essere classificati in diversi morfotipi con profili virulenti o attenuati quando interagiscono con le cellule ospiti. Ad esempio, l'assenza di glicopeptidolipidi (GPL) nel morfotipo grezzo di Mycobacterium abscessus è stato associato alla capacità di indurre acidificazione intrafagosomica, e di conseguenza apoptosi cellulare9, a differenza del morfotipo liscio che possiede GPL nella loro superficie. Inoltre, il contenuto lipidico della parete cellulare micobatterica è correlato alla capacità di modificare la risposta immunitaria nell'ospite. Questo è rilevante nel contesto dell'uso di alcuni micobatteri per innescare un profilo immunitario protettivo contro diverse patologie10,11,12,13. È stato dimostrato, ad esempio, che Mycolicibacterium vaccae, un micobatterio saprofita, che è attualmente in studi clinici di fase III come vaccino immunoterapeutico per la tubercolosi, mostra due morfotipi coloniali. Mentre il fenotipo liscio, che contiene un poliestere nella sua superficie, innesca una risposta Th2, il fenotipo ruvido privo del poliestere può indurre un profilo Th1 quando interagisce con le cellule immunitarie dell'ospite14. Il repertorio di lipidi presenti nella cellula micobatterica non dipende solo dalle specie di micobatteri, ma anche dalle condizioni delle colture micobatteriche: tempo di incubazione15,16 o composizione del terreno di coltura17,18. Infatti, i cambiamenti nella composizione del terreno di coltura influenzano l'attività antitumorale e immunostimolante di M. bovis BCG e Mycolicibacterium brumae in vitro17. Inoltre, il profilo immunitario protettivo innescato da M. bovis BCG contro M. tuberculosis la sfida nei modelli di topi dipende anche dai mezzi di coltura in cui M. bovis BCG cresce17. Questi potrebbero quindi essere correlati alla composizione lipidica dei micobatteri in ogni condizione di coltura. Per tutti questi motivi, lo studio del contenuto lipidico dei micobatteri è rilevante. Viene presentata una procedura visiva per estrarre e analizzare la composizione lipidica della parete cellulare micobatterica.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Estrazione dei lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (Figura 1)

  1. Graffiare 0,2 g di micobatteri da un mezzo solido e aggiungere a un tubo di vetro con tappi a vite in politetrafluoroetilene (PTFE). Aggiungere una soluzione composta da 5 ml di cloroformio e 10 ml di metanolo (cloroformio:metanolo, 1:2).
    NOTA: quando si cioè abituati solventi organici, deve essere utilizzato solo il recipiente di vetro. Non sono ammessi contenitori di plastica. Inoltre, sono necessari tappi a vite in PTFE per bottiglie.
    ATTENZIONE: Il cloroformio è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: Il metanolo è una sostanza potenzialmente tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  2. Lasciare il tubo in costante agitazione durante la notte per estrarre i lipidi non legati ai covalenti dalla superficie cellulare micobatterica.
    NOTA: se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile.
  3. Coprire un imbuto di vetro con una carta da filtro, filtrare i solventi organici e raccoglierli in un tubo di vetro.
  4. Utilizzare un flusso di gas azoto per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire il tubo con azoto gassoso, coprirlo e conservarlo a 4 °C.
    NOTA: Collegare una pipetta Pasteur di vetro al flusso di azoto gassoso per far evaporare specificamente il tubo desiderato. Inoltre, mantenere il tubo all'interno di un riscaldatore a blocchi asciutti per tubi a 37 °C. Quando il solvente evapora, riempire il tubo con azoto gassoso prima di chiuderlo.
  5. Aggiungere 15 mL di una soluzione di cloroformio:metanolo (2:1) ai detriti cellulari. Lasciare il tubo in costante agitazione durante la notte per estrarre i lipidi non legati ai covalenti dalla superficie cellulare micobatterica.
    NOTA: se non è disponibile una piattaforma di agitazione orbitale, l'agitazione costante può essere sostituita da un'agitazione manuale periodica il più frequentemente possibile.
  6. Lasciare riposare la miscela per 1 ora. Con una pipetta Pasteur, recuperare i solventi organici. Coprire un imbuto di vetro con una carta da filtro e filtrare i solventi organici e raccoglierli nello stesso tubo di vetro precedentemente utilizzato nella fase 1.3. Utilizzare un flusso di gas azoto per far evaporare la fase liquida nel tubo. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservarlo nuovamente a 4 °C.

2. Estrazione dell'acido micolico mediante metanolosi acida (Figura 2A)

  1. Aggiungere 2-5 ml di soluzione esterificante in un tubo di vetro ermetico con un tappo a vite in PTFE. Aggiungere 0,2 g di biomassa di micobatteri nel tubo di vetro.
    NOTA: La soluzione esterificante si forma mescolando 30 ml di metanolo, 15 ml di toluene e 1 mL di acido solforico. Le cellule dei micobatteri possono essere prelevate da colture solide o, anche, da cellule delipidate dopo aver eseguito l'estrazione di lipidi totali non legati ai covalenti dai micobatteri (cellule rimanenti dopo il filtraggio nella fase 1.6).
    ATTENZIONE: Il toluene è una sostanza infiammabile ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'acido solforico è una sostanza corrosiva e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  2. Mescola il contenuto vorticosamente. Lasciare riposare la miscela all'interno di un bagno asciutto a 80 °C durante la notte.
  3. Lasciare raffreddare il tubo fino a raggiungere la temperatura ambiente e quindi aggiungere 2 ml di n-esano al tubo. Mescolare il contenuto vorticosamente per 30 s e lasciare che il tubo si depositi fino a quando non compaiono due fasi chiare.
    ATTENZIONE: l'n-esano è una sostanza potenzialmente infiammabile, irritante, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  4. Recuperare la fase superiore corrispondente alla fase n-esano. Trasferiscilo su un nuovo tubo.
  5. Ripetere il passaggio 2.3. Recuperare nuovamente la fase superiore e trasferirla nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 2.4.
  6. Evaporare il contenuto del tubo utilizzando un flusso di gas azoto. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservarlo a 4 °C.

3. Estrazione dell'acido micolico mediante saponificazione e metilazione (Figura 2B)

  1. Graffiare 0,2 g di micobatteri da un supporto solido e aggiungere a un tubo di vetro con un tappo a vite in PTFE.
  2. Aggiungere 2 ml di soluzione di metanolo-benzene (80:20) contenente idrossido di potassio al 5%. Mescolare il contenuto vorticosamente. Riscaldare la miscela per 3 ore a 100 °C.
    ATTENZIONE: Il benzene è una sostanza infiammabile, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  3. Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente. Aggiungere il 20% di acido solforico per acidificare i campioni per ottenere pH = 1.
  4. Aggiungere 3 ml di etere etilico. Mescolare delicatamente il contenuto vorticosamente.
  5. Lascia che le due fasi si formino assestandosi. Recuperare la fase dell'etere etilico e trasferirla in un nuovo tubo. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
  6. Lavare l'estratto di etere etilico con 2 ml di acqua distillata e trasferire la parte superiore corrispondente all'etere etilico in un nuovo tubo. Ripetere la fase di lavaggio per un totale di tre volte.
  7. Aggiungere 2 g di solfato di sodio anidro sopra l'estratto di etere etilico per asciugarlo.
  8. Filtrare la sospensione. Evaporare il contenuto utilizzando un flusso di gas azoto.
  9. Per eseguire la fase di metilazione, sciogliere 3 g di N-nitroso-N-metilurea in una soluzione preraffreddata formata da 45 ml di etere etilico e 9 ml di KOH al 40% in acqua distillata.
    ATTENZIONE: N-nitroso-N-metilurea è una sostanza tossica, irritante, cancerogena e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  10. Trasferire il surnatante (diazometano) in un nuovo pallone raffreddato in ghiaccio contenente pellet di idrossido di potassio (circa 30 g).
    NOTA: Se il surnatante non viene utilizzato immediatamente, può essere conservato a -20 °C per un massimo di 1 ora.
    ATTENZIONE: I pellet di idrossido di potassio sono una sostanza irritante e corrosiva. Questo materiale deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: Il diazometano è altamente tossico e potenzialmente esplosivo. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare con vetro di sicurezza che indossa adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  11. Aggiungere 2 mL della soluzione di etere contenente diazometano, ottenuta nella fase 3.10, nell'estratto essiccato di etere etilico contenente acidi micolici, ottenuto nella fase 3.8. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  12. Evaporare la sospensione a 40 °C. Riempire il tubo con azoto gassoso, chiuderlo e conservare i lipidi metilati a 4 °C.
    NOTA: Evaporare il diazometano dalla soluzione di etere sotto la cappa a flusso laminare, fino a quando l'etere perde il colore giallo.

4. Analisi cromatografica su strato sottile (TLC)

  1. Saturare la camera TLC di vetro. Per fare questo, coprire una delle pareti della camera TLC con un pezzo di carta da filtro e lasciarlo a contatto con la fase mobile composta dalla miscela di solventi. Posizionare il volume rimanente del solvente sul fondo della camera TLC.
    NOTA: Il fondo della camera TLC deve essere coperto da almeno 1 cm della fase mobile. Nei presenti esperimenti, sono state utilizzate diverse fasi mobili per sviluppare i TLC. Consistevano in 85 mL di n-esano più 15 mL di etere etilico; 100 ml di diclorometano; 90 mL di cloroformio, 10 ml di metanolo e 1 mL di acqua; 30 ml di cloroformio, più 8 ml di metanolo e 1 mL di acqua; 60 ml di cloroformio, più 35 ml di metanolo e 8 ml di acqua; 95 mL di cloroformio più 5 ml di metanolo; e 90 mL di etere di petrolio (60-80 °C) più 10 ml di etere etilico.
    NOTA: Nella TLC bidimensionale, utilizzare n-esano:acetone (95:5) nella prima direzione tre volte e utilizzare un singolo sviluppo con toluene:acetone (97:3) nella seconda direzione per analizzare la composizione dell'acido micolico. Per analizzare i PIM, utilizzare cloroformio:metanolo:acqua (60:30:6) nella prima direzione una volta, e usare cloroformio:acido acetico:metanolo:acqua (40:25:3:6) nella seconda direzione. Per analizzare PDIM e AG, utilizzare l'etere di petrolio (60-80 °C): acetato di etile (98: 2) nella prima direzione tre volte e utilizzare un singolo sviluppo con etere di petrolio (60-80 ° C): acetone (98: 2) nella seconda direzione.
    ATTENZIONE: L'etere etilico è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: Il diclorometano è una sostanza potenzialmente tossica e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'etere di petrolio è una sostanza potenzialmente infiammabile, dannosa per l'ambiente ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'acido acetico è una sostanza potenzialmente infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'acetato di etile è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'acetone è una sostanza infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
  2. Chiudere la camera TLC per saturarla per almeno 20 minuti. Nel frattempo, sciogliere i lipidi presenti nel tubo di vetro in 0,2-1 ml di cloroformio.
    NOTA: Il volume utilizzato per sciogliere i lipidi può essere modificato a seconda della concentrazione desiderata o prevista del campione.
  3. Applicare 10 μL di ogni sospensione utilizzando un tubo di vetro capillare direttamente sulla piastra TLC e lasciare asciugare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: I campioni devono essere applicati nella parte inferiore della piastra lasciando 1 cm su ciascun lato. I campioni devono essere separati l'uno dall'altro per almeno 0,5 cm. Una volta applicato il campione sulla piastra, i tubi possono essere nuovamente evaporati con azoto gassoso e conservati a 4 °C per un ulteriore utilizzo.
  4. Inserire la piastra nella camera TLC satura contenente la fase mobile. Consenti alla fase mobile di passare attraverso la TLC.
    NOTA: qualsiasi movimento applicato alla camera TLC influisce sul solvente in esecuzione sulla piastra e influisce sulla mobilità lipidica. Nel caso di esecuzione di TLC bidimensionali, sono necessarie due camere TLC per contenere entrambi i sistemi di eluizione.
  5. Rimuovere la piastra dalla camera TLC quando il solvente raggiunge 1 cm di distanza dall'estremità superiore della piastra. Lasciare la piastra sotto flusso laminare fino a quando la silice non è completamente asciutta.
    NOTA: Nel caso di analisi della composizione dell'acido micolico, utilizzando n-esano e etere dietile (85:15), ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 due volte di più, fino a eseguire la fase mobile tre volte sulla piastra TLC.
  6. Rivelare la piastra con la macchia richiesta; riscaldare la piastra se necessario.
    NOTA: Nel presente esperimento, sono stati utilizzati 15-20 ml delle seguenti soluzioni per spruzzare le piastre TLC: 10% di idrato di acido molibdatofosforico in etanolo fino a quando la piastra è di colore giallo brillante, seguito dal riscaldamento della piastra a 120 °C; 5% in etanolo del 20% α-naftolo in acido solforico seguito da riscaldamento della piastra a 120 °C; Reagente blu di molibdeno (1,3% di ossido di molibdeno in acido solforico 4,2 M) fino a quando non sono comparse bande di fosfato o 1% di antrone in acido solforico.
    ATTENZIONE: L'acido molibdatofosforico idrato è una sostanza infiammabile e corrosiva. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: L'etanolo è una sostanza potenzialmente infiammabile e pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: 1-Naphthol è una sostanza infiammabile, corrosiva ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).
    ATTENZIONE: Molibdeno Blue Spray Reagent è una sostanza corrosiva, tossica ed estremamente pericolosa. Deve essere utilizzato in una cappa a flusso laminare indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (cappotto da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile).

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Risultati

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Con l'obiettivo di mostrare una vasta gamma di lipidi presenti in diverse specie di micobatteri, M. bovis BCG è stato selezionato in quanto è un micobatteri ruvido e a crescita lenta. Nella procedura sono stati aggiunti M. fortuitum e M. brumae ruvidi e a crescita rapida e, infine, è stato incluso anche il morfotipo liscio di M. abscessus. Queste quattro specie ci permettono di visualizzare un ampio spettro di lipidi derivati da micobatteri come acilmalosi (AT), GPL, PDIM, PGL, PIM, T...

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Discussione

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Viene presentato un semplice protocollo considerato come il metodo gold standard per l'estrazione di composti lipidici non legati in modo covalente dalla parete cellulare micobatterica. Viene mostrata un'ulteriore visualizzazione da parte di TLC mono e bidimensionali dai lipidi estratti di quattro diversi micobatteri.

Due miscele combinate consecutive di cloroformio e metanolo per recuperare il contenuto lipidico delle cellule micobatteriche è la miscela solvente più utilizzata

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero spagnolo della Scienza, dell'Innovazione e delle Università (RTI2018-098777-B-I00), dai Fondi FEDER e dalla Generalitat della Catalogna (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido è la destinataria di un contratto di dottorato (FI) presso la Generalitat de Catalunya.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aceticoMerck100063ATTENZIONE. Anidro per analisi EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NATTENZIONE. ACETONE RPE-ACS-ISO PER ANALISI ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone per sintesi.
BenzeneCarlo Erba426113ATTENZIONE. Benzene RPE - Per analisi - ACS 2,5 l
Tubo capillare in vetroMerckBR708709BRAND®   usa e getta BLAUBRAND®   micropipette, intraMark
CloroformioCarlo Erba412653ATTENZIONE. Cloroformio RS - Per HPLC - Grado isocratico - Stabilizzato con etanolo 2,5 L
Riscaldatore a blocco seccoJ.P. Selecta7471200
DiclorometanoCarlo Erba412622ATTENZIONE. Diclorometano RS - Per HPLC - Grado isocratico - Stabilizzato con amilene 2,5 L
Etere dietilicoCarlo Erba412672ATTENZIONE. Etere etilico RS - Per HPLC - Grado isocratico - Panreac in acetato di etile da 2,5 L non stabilizzato
1313181211ATTENZIONE. L'acetato di etile (Reag. USP, Ph. Eur.) per l'analisi, ACS, Assoluta di
Alcool EtilicoCarlo Erba4146072ATTENZIONE. Etanolo anidro assoluto RPE - Per analisi - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Imbuto in vetroVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Tubo in vetroVidraFOCVFOC.45066A-16125Tubo in vetro con tappo recuperato in PTFE
MetanoloCarlo Erba412722ATTENZIONE. Metanolo RS - Per HPLC - ORO - Acido
molibdatofosforicoMerck51429-74-4ATTENZIONE.
Reagente spray blu di molibdeno, 1,3%SigmaM1942-100MLATTENZIONE.
n-esanoCarlo Erba446903ATTENZIONE. n-Esano 99% RS - ATRASOL - Per analisi di tracce 2,5 L
n-nitroso-n-metilureaSigmaN4766ATTENZIONE
Piattaforma di agitazione orbitaleDDBiolab995018NB-205L incubatore di agitazione da banco
Etere di petrolio (60-80º C)Carlo Erba427003ATTENZIONE. Etere di petrolio 60 - 80 gradi C RPE - Per analisi Spruzzatore da 2,5 L
VidraFOC712/1
Solfato di sodio anidroMerck238597
Acido solforico 95-97%Merck1007311000ATTENZIONE. Acido solforico 95-97%
TLC cameraMerckZ204226-1EASerbatoi di sviluppo TLC rettangolari, completi L & H &volte; L 22 cm & 22 cm & tempi; Piastra TLC da 10 cm
Merck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
Riscaldatore a piastre TLCCAMAG223306CAMAG Riscaldatore a piastre TLC III
TolueneCarlo Erba488551ATTENZIONE. Toluene RPE - Per analisi - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA  Agitador IKA vó rtex 3
1-naftoloSigma-Aldrich102269427ATTENZIONE.
ISO da 2,5 L di grado ultragradiente

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232(2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734(2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).

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