In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l'analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.
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Articolo metodologico
Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l'attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell'actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell'actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l'endocitosi.
Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l'intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l'esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l'analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l'analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.
Introduzione
Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell'actina con l'aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L'esaurimento del complesso Arp2/3 o l'interruzione delle vie di segnalazi....
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Protocollo
1. Semina cellulare
NOTA: Il protocollo di diffusione cellulare descritto è stato eseguito utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP (un marcatore fluorescente per PIP3/PI(3,4)P2). Questa linea cellulare è stata generata integrando genomicamente un costrutto di espressione per PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante editing genico mediato da CRISPR. Tuttavia, altri marcatori fluorescenti che sono espressi transitoriamente o integrati nel genoma possono anche essere utilizzati in questo saggio. Per una segmentazione ottimale dell'immagine, si consiglia di utilizzare marcatori fluorescenti dist....
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Risultati
Il protocollo di cui sopra descrive le procedure sperimentali per l'imaging a cellule vive di cellule di diffusione e uno strumento computazionale per l'analisi quantitativa della dinamica di diffusione cellulare. Lo strumento computazionale può essere utilizzato in un formato a bassa o alta produttività per identificare i lettori molecolari che regolano i macchinari di polimerizzazione dell'actina all'avanguardia cellulare.
La rappresentazione schematica delle procedure sperimentali è illustr.......
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Discussione
Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazione.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,05% tripsina (0,05%), 0,53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| Piastra di Petri da 10,0 cm, polistirene, trattato TC, ventilato | Starstedt | 83.3902 | |
| Provetta da centrifuga in PP ad alta trasparenza da 15 mL, fondo conico, con tappo a vite con chiusura a cupola, | Falcon | sterile 352097 | |
| Chamlide CMS a 1 pozzetto per vetrino coprioggetti da 22 mm x 22 mm | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| Piatto per coltura cellulare da 35 mm con trattamento TC Easy-Grip Falcon | |||
| Provetta da centrifuga da 50 mL, trasparente, con chiusura a tappo | Nest | 602002 | |
| Piastre per colture cellulari da 6,0 cm trattate per un maggiore attaccamento cellulare, sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Fotometrico | ||
| Dimetil solfossido, sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4,5 g/L di glucosio, con L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenolo | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, senza fenolo rosso | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Siero fetale bovino | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Plasma umano Fibronectina Proteina purificata 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Olio da immersione | Cargille | 16241 | |
| Soluzione di L-glutammina (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro, quadrati, n. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| , obiettivo Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| , olio CFI Plan Apo Lambda 60X | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma | P4333 | |
| Disco rotante, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubatore | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, | Prism GraphPad | ||
| , stile 2 | Microscopia elettronica | Scienze 78326-42 |
Riferimenti
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.
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Ristampe e permessi
