Articolo metodologico

Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare

DOI:

10.3791/62369

⸱

22 maggio 2021

 ,  , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l'analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l'attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell'actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell'actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l'endocitosi.

Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l'intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l'esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l'analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l'analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell'actina con l'aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L'esaurimento del complesso Arp2/3 o l'interruzione delle vie di segnalazione essenziali per le sporgenze lamellipodiali spesso compromettono la migrazionecellulare 6, 7. Sebbene sia stata segnalata anche la migrazione di cellule carenti di lamellipodia8,9, l'importanza della lamellipodia nella migrazione cellulare è evidente in quanto l'esaurimento di questa struttura protrusiva perturba la capacità della cellula di muoversi attraverso complessi microambientatibiologici 6,10.

Uno dei principali ostacoli alla comprensione della regolazione della lamellipodia nelle cellule migratrici è la variabilità naturale nella cinetica, nelle dimensioni e nella forma della protrusione lamellipodale11,12,13,14. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i lamellipodia mostrano comportamenti protrusivi complessi, tra cui sporgenze fluttuanti, periodiche e acceleranti14,15. Rispetto alla lamellipodia altamente variabile delle cellule migratrici6,16,lamellipodia formata durante la diffusione cellulare sono piùuniformi 12. Poiché l'attività protrusiva di diffusione e migrazione delle cellule è guidata da assiemi macromolecolari identici, che includono una rete actina ramificata, fasci di actomiosina contrattili e aderenze a matrice cellulare a base di integrina17,18, le cellule di diffusione sono state ampiamente utilizzate come modello per indagare la regolazione della dinamica della lamellipodia.

La diffusione cellulare è un processo meccanochimico dinamico in cui una cellula in sospensione aderisce prima a un substrato attraverso aderenze a base di integrina17,19,20 e poi si diffonde estendendo le sporgenze a base di actina21,22,23. Durante la fase di diffusione, lamellipodia che emana dal corpo cellulare sporge isotropicamente e persistentemente con poca o nessuna retrazione o stallo12. I protocolli di diffusione cellulare più comunemente utilizzati sono test di endpoint, in cui le cellule di diffusione sono fissate in vari momenti dopo laplaccatura 19,24. Questi test, sebbene rapidi e semplici, sono limitati nel loro potere diagnostico per rilevare i cambiamenti nelle caratteristiche dinamiche della lamellipodia. Per determinare i meccanismi molecolari che controllano la dinamica lamellipodia, il gruppo Sheetz ha aperto la strada all'uso dell'analisi quantitativa delle cellule di diffusione dal vivo e ha scoperto molte proprietà fondamentali delle sporgenze dei bordi cellulari11,12,22. Questi studi hanno dimostrato che il saggio di diffusione delle cellule vive è una tecnica robusta e potente nella cassetta degli attrezzi di un laboratorio di biologia cellulare. Nonostante ciò, un protocollo dettagliato e uno strumento computazionale open source per un saggio di diffusione di cellule vive non sono attualmente disponibili per la comunità della biologia cellulare. A tal fine, il nostro protocollo delinea le procedure di imaging delle cellule di diffusione dal vivo e fornisce uno strumento automatizzato di analisi delle immagini. Per convalidare questo metodo, abbiamo usato l'inibizione dell'Arp2/3 come trattamento sperimentale e abbiamo dimostrato che inibire la funzione del complesso Arp2/3 non ha arrestato la diffusione cellulare ma ha causato una significativa riduzione della velocità di protrusione cellulare, così come la stabilità delle sporgenze del bordo cellulare, dando origine a bordi cellulari frastagliati. Questi dati dimostrano che la combinazione di imaging a cellule vive e analisi automatizzata delle immagini è uno strumento utile per analizzare la dinamica dei bordi delle cellule e identificare componenti molecolari che regolano lamellipodia.

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Protocollo

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1. Semina cellulare

NOTA: Il protocollo di diffusione cellulare descritto è stato eseguito utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP (un marcatore fluorescente per PIP3/PI(3,4)P2). Questa linea cellulare è stata generata integrando genomicamente un costrutto di espressione per PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante editing genico mediato da CRISPR. Tuttavia, altri marcatori fluorescenti che sono espressi transitoriamente o integrati nel genoma possono anche essere utilizzati in questo saggio. Per una segmentazione ottimale dell'immagine, si consiglia di utilizzare marcatori fluorescenti distribuiti uniformemente nel citoplasma, ad esempio GFP citosolico.

  1. Coltura un piatto di cellule da 10 cm al 90% di confluenza.
  2. Una volta che le cellule hanno raggiunto la corretta confluenza, posizionare una coverlip di 22 mm x 22 mm (spessore #1,5; 0,17 mm) in un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Rivestire il copripazzo con 400 μL di fibronectina che è stato diluito in PBS ad una concentrazione finale di 2,5 μg/mL.
    NOTA: Il numero di coverlips necessari per il saggio è determinato dal numero di condizioni sperimentali e dalla replica tecnica.
  3. Posizionare il piatto da 35 mm con la coverslip rivestita con fibronectina in un incubatore di 37 °C, 5% DI CO2 per 1 ora.
  4. Rimuovere il piatto con il copripasci dall'incubatrice. Aspirare la fibronectina e lavare il copripavimenti con PBS tubazione delicatamente intorno al coperchio due o tre volte.
  5. Aspirare il supporto di coltura cellulare dal piatto di cellule di 10 cm e lavare il piatto con PBS.
  6. Aggiungere 650 μL dello 0,05% di tripsiderina-EDTA al piatto confluente al 90% delle cellule, inclinando il piatto per distribuire uniformemente l'enzima. Posizionare il piatto con la triptina nell'incubatrice per 1 minuto.
  7. Rimuovere il piatto con le cellule dall'incubatrice. Aggiungere 10 ml di mezzi di coltura cellulare in un tubo di centrifuga da 15 ml. Aggiungere rapidamente altri 10 mL di supporti nel piatto per spegnere la tripina.
  8. Pipetta 1 ml delle cellule tripsinizzate nel tubo di centrifuga da 15 ml per diluire le cellule. Pipettare il contenuto del tubo su e giù per garantire una distribuzione uniforme delle celle all'interno del supporto. Per i tipi di cellule con elevata propensione all'aggregazione, si consiglia di filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare (dimensione della rete di 100 μm) per ridurre al minimo il verificarsi di raggruppamento cellulare.
  9. Dal tubo, pipetta 500 - 1000 μL di cellule diluite nel piatto da 35 mm contenente il coverslip.
  10. Agitare delicatamente il piatto per stendere uniformemente le cellule. Assicurarsi che il coverslip sia a una confluenza di ~10% (~50.000 celle/mL) e regolare il volume delle celle diluite in base alle esigenze.
    NOTA: Lo scopo di avere cellule a così bassa confluenza è quello di garantire che ci siano 1-2 cellule polarizzate in ogni campo visivo che verranno utilizzate per focalizzare l'obiettivo durante l'acquisizione della diffusione cellulare.
  11. Passaggio 1/5 delle cellule rimanenti nel piatto di 10 cm in un piatto di 6 cm per condizione di trattamento. Posizionare i piatti passaggi e il piatto da 35 mm con la coverlip nell'incubatrice durante la notte.
    NOTA: Queste saranno le cellule che verranno analizzate per la diffusione della dinamica.

2. Incubazione di farmaci e recupero cellulare

  1. Aggiungere 5 ml di mezzi di coltura cellulare in ciascuno dei due tubi di centrifuga da 15 ml e 20 ml di DMEM privo di fenolo rosso in ciascuno dei due tubi di centrifuga da 50 ml.
    NOTA: Il numero di coppie di tubi (15 mL + 50 mL) deve corrispondere al numero di condizioni sperimentali.
  2. Per verificare l'importanza dell'Arp2/3 per la diffusione cellulare, pipettare l'inibitore farmacologico di Arp2/3, CK-666, o il trattamento di controllo, come DMSO, in ogni coppia di tubi di centrifuga fino alla concentrazione desiderata.
  3. Rimuovere i piatti di 6 cm (vedere passaggio 1.11) dall'incubatore e aspirare il supporto. Lavare i piatti con PBS caldo.
  4. Aggiungere il contenuto dei tubi di centrifuga da 15 ml integrati con CK-666 o DMSO in ciascuno dei piatti passaggi. Etichettare ogni piatto con il corretto trattamento farmacologico e posizionare i piatti nell'incubatrice per un'ora.
  5. Rimuovere i piatti dall'incubatore e aspirare il supporto. Lavare i piatti con PBS caldo per rimuovere accuratamente tutti i restanti mezzi rosso fenolo.
  6. Aggiungere 230 μL di 0,05% di tripsiderina-EDTA a ogni piatto da 6 cm e incubare le cellule per 1 minuto.
    NOTA: Se applicabile, la tripsidena può essere sostituita da un blocco dell'adesione delle cellule non proteolitiche.
  7. Rimuovere i piatti dall'incubatrice. Per ogni trattamento, aggiungere 5 ml di DMEM privo di fenolo rosso integrato dal farmaco in un tubo di centrifuga da 15 ml designato come "Tubo B". Aggiungere altri 5 mL dello stesso supporto nel piatto pertinente per dissetare la tripina. Trasferire il contenuto del piatto in un tubo di centrifuga da 15 ml designato come "Tubo A".
  8. Trasferire 1 ml di cellule dal tubo A al tubo B. Ripetere per ogni trattamento.
  9. Posizionare i tubi A e B nell'incubatore per 45 minuti per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsinizzazione. Allentare leggermente il tappo dei tubi della centrifuga prima di posizionarli nell'incubatrice per consentire la penetranza di CO2.
    NOTA: la durata del tempo di recupero può variare per diversi tipi di cella. Sebbene nei nostri esperimenti il recupero di 45 minuti abbia avuto un effetto trascurabile sulla vitalità cellulare, alcuni tipi di cellule possono subire anoikis quando mantenuti in sospensione per troppo tempo. Pertanto, si consiglia di determinare empiricamente il tempo di recupero ottimale. Il tempo di ripristino ottimale consente la diffusione rapida e sincrona delle celle senza celle morte o apoptotiche nel campione.

3. Preparazione della camera magnetica

  1. Assicurarsi che tutte le parti di una camera magnetica a cella a camlide bene in grado di ospitare una coverlip quadrata di 22 mm x 22 mm siano state pulite prima dell'uso.
  2. Rimuovere il piatto da 35 mm con il copripasci (vedere passaggio 1.11) dall'incubatore. Aspirare il supporto di coltura cellulare e lavare il copripavimenti con PBS caldo.
  3. Rimuovere il copripavo dal piatto da 35 mm utilizzando un paio di forcep e posare delicatamente il coverslip sulla piastra inferiore della camera magnetica.
  4. Posizionare la guarnizione in silicone sopra la coverlip.
    NOTA: Una guarnizione in silicone posizionata in modo improprio è la causa più comune di una camera magnetica che perde. Assicurarsi che la guarnizione si riposi nel rientro della piastra inferiore e non si alzerà oltre il rientro.
  5. Attaccare il corpo principale sulla piastra inferiore.
    NOTA: Fai questa parte molto lentamente. Una buona punta è quella di tenere premuta la piastra inferiore con una mano mentre si posiziona il corpo principale in cima. Ciò garantisce che i magneti del corpo principale non sollevino la piastra inferiore verso l'alto, il che potrebbe potenzialmente spostare e rompere il copripasci.
  6. Aggiungere 1 mL di DMEM privo di fenolo rosso integrato dal farmaco alla camera magnetica. Prendi un tessuto privo di pelucchi e tampona con cura l'involucro tra il corpo principale e la piastra inferiore per verificare eventuali perdite.
    NOTA: In caso di perdite, aspirare rapidamente il supporto e procedere di nuovo dal passaggio 3.4.
  7. Abbassare il coperchio trasparente sul corpo principale per racchiudere la camera magnetica.
  8. Spruzzare prima un tessuto da laboratorio con acqua e pulire il fondo della camera magnetica (il coverslip, non la parte metallica). Successivamente, spruzzare un secondo tessuto da laboratorio con una piccola quantità di etanolo e pulire al 70%, facendo attenzione a non rompere il coverslip.

4. Acquisizione di immagini

  1. Preriscaldare l'incubatore superiore dello stadio e il riscaldatore obiettivo a 37 °C e impostare il livello di CO2 nell'incubatore superiore dello stadio al 5%.
    NOTA: Se l'incubatore superiore dello stadio non è collegato a un alimentatore di CO2, il supporto di coltura cellulare deve essere integrato con HEPES da 25 mM per mantenere un pH costante 7.4.
  2. Applicare una quantità sufficiente di olio ad immersione all'obiettivo olio prerifapidto 60X, 1.4 N.A.
    NOTA: Utilizziamo un obiettivo di immersione dell'olio 60X, 1.4 N.A. in questo protocollo a causa del suo campo visivo ragionevolmente ampio e dell'eccezionale efficienza di raccolta della luce. Se è necessario un campo visivo più ampio, è possibileutilizzare un obiettivo diingrandimento inferiore ( ad esempio , 20x) purché il rapporto segnale-rumore delle immagini sia maggiore di 2,5.
  3. Portare sia la camera magnetica completata che il tubo B (fase 2.9) al microscopio confocale. Posizionare la camera magnetica sull'incubatore superiore del palco.
    NOTA: Posizionare delicatamente la camera magnetica sul palco per evitare di creare bolle nell'olio ad immersione.
  4. Impostare lo stato attivo sulle celle fluorescenti utilizzando il canale GFP. Assicurarsi che il bordo della cella sia nitido e ben definito.
  5. Rimuovere il coperchio trasparente della camera magnetica e pipettare 500 μL dal tubo B nella camera magnetica. Riposizionare il coperchio trasparente sopra la camera magnetica.
  6. Per identificare le cellule ideali per l'analisi della diffusione cellulare, cercare "aloni" di cellule che devono ancora attaccarsi al coverslip ma non rotolano più. Anche le celle che si trovano nelle prime fasi dell'allegato coverslip sono ottimi candidati, ma l'acquisizione di immagini deve essere rapida per catturare la diffusione.
  7. Configurare l'acquisizione dell'immagine time-lapse per il canale verde in modo che includa quattro campi di visualizzazione, con immagini a intervalli di 6 secondi.
    NOTA: A causa dell'elevata variabilità della velocità di protrusione della lamellipodia tra i diversi tipi di cellule, la frequenza fotogrammi ottimale deve essere determinata empiricamente. L'intervallo di imaging di 6 secondi utilizzato nei nostri esperimenti è un buon punto di partenza per l'analisi di molte cellule mesenchimali ed epiteliali. Tuttavia, le cellule che si diffondono moltorapidamente (ad esempio,cellule immunitarie) possono richiedere una frequenza fotogrammi molto più elevata (intervallo di imaging più breve). La frequenza fotogrammi ottimale per i filmati di diffusione delle celle garantisce uno spostamento di 2-5 pixel del bordo della cella sporgente tra i fotogrammi successivi. Considerando l'accuratezza del raccordo a curva utilizzato per identificare l'altopiano della diffusione delle cellule, la frequenza ottimale del telaio dovrebbe anche garantire 50-100 misurazioni dello spostamento del bordo cellulare durante la fase di rapida espansione della diffusione cellulare. Il numero di campi di visualizzazione deve essere regolato in base al tempo di esposizione, alla distanza tra i punti di acquisizione e alla velocità di movimento dello stadio. Si consiglia agli utenti di determinare il numero massimo di campi di visualizzazione che possono essere acquisiti con la frequenza fotogrammi desiderata.
  8. Dopo aver identificato un campo visivo adatto, salvare le coordinate X e Y dello stadio del microscopio. Procedere con l'identificazione di altri tre campi di visualizzazione relativamente vicini l'uno all'altro sulla coverslip. Salvare le coordinate dello stadio del microscopio per ogni campo visivo desiderato.
    NOTA: Si consiglia vivamente di ottimizzare il percorso di movimento dello stadio tra i campi visivo al fine di ridurre al minimo qualsiasi movimento del campione non necessario. Tale ottimizzazione può essere eseguita manualmente o automaticamente. Un eccessivo movimento del campione rallenta l'acquisizione e può causare l'implementazione delle celle fuori dalla vista mentre scendono.
  9. Acquisisci immagini per 15 minuti a una frequenza fotogrammi di 6 secondi e salva i file. Se sono necessarie altre acquisizioni, ripetere a partire dal passaggio 4.6.

5. Analisi dell'area cellulare, circolarità e dinamica di protrusione durante la diffusione cellulare

  1. Preparare le immagini per l'elaborazione e l'analisi dei dati
    NOTA: il software richiede un'immagine in .tiff e una dimensione in pixel come parametri di input. Entrambi i requisiti possono essere soddisfatti utilizzando il software di acquisizione o Fiji (in questo protocollo). Se questi requisiti sono soddisfatti, procedere al passaggio 5.2.
    1. Installare l'ultima versione dell'applicazione Fiji (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Apri un'immagine time-lapse usando Fiji.
    3. Copiare le dimensioni in pixel dell'immagine selezionando Immagine > proprietà. Copiare e incollare le dimensioni dei pixel in μm nel Blocco note/Word.
    4. Per l'analisi dell'area di diffusione delle celle e della circolarità, salvate l'immagine time-lapse come stack di immagini tiff. Il software di analisi della compilazione personalizzata non supporta formati di file proprietari. Salvare lo stack di immagini tiff delle singole celle selezionando File > Salva con nome > Tiff.
  2. Installare python IDE (Spyder) e i pacchetti necessari (PySimpleGUI e tifffile) per l'elaborazione e l'analisi dei dati.
    NOTA: L'installazione di Python e pacchetti è necessaria solo per la configurazione iniziale.
    1. I film time-lapse verranno analizzati nell'IDE Spyder utilizzando uno script Python di compilazione personalizzata. Per scaricare l'IDE Spyder, scarica il distributore Anaconda (https://www.anaconda.com/products/individual) che include Spyder IDE e la maggior parte delle librerie e dei pacchetti necessari per questa analisi.
    2. Installa Anaconda e lancia Spyder tramite Anaconda Navigator.
    3. Nella scheda della console IPython (situata nella sezione in basso a destra di Spyder), copiare e incollare il comando seguente: pip installare PySimpleGUI e premere INVIO. L'esecuzione di questo comando installerà il pacchetto necessario per avviare l'interfaccia utente grafica (GUI).
    4. Nella stessa console copiare e incollare il comando seguente: pip install tifffile e premere INVIO. L'esecuzione di questo comando installerà il pacchetto necessario per salvare le immagini come file tiff.
    5. Scarica tutti gli script Python dai file supplementari o dagli script più aggiornati da GitHub all'https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
  3. Quantificare l'area cellulare e i fattori di forma cellulare durante la diffusione cellulare
    1. Aprire lo script di analisi principale "cell_spreading_GUI.py" selezionando l'opzione apri file nel pannello superiore di Spyder o utilizzando il collegamento CTRL+O.
    2. Aprire l'interfaccia utente grafica di analisi della diffusione delle celle selezionando "Esegui file" nel pannello superiore o utilizzando il collegamento F5.
    3. Fare clic sulla scheda Area di diffusione celle ( Figura3A).
    4. Selezionare l'immagine tiff da analizzare utilizzando il pulsante sfoglia.
      NOTA: il file selezionato deve essere un file tiff.
    5. Specificare la directory di destinazione in cui verranno salvati gli output dei dati (ad esempio, maschere di cella, valori).
    6. Specificare le impostazioni di output dei dati:
      1. Salva maschere: salva le maschere di cella generate durante il processo di segmentazione.
      2. Esportare dati: esportare un foglio di calcolo di Excel (.xlsx) contenente tutti i dati di analisi nella cartella di destinazione.
        L'area delle celle, la circolarità e le proporzioni di tutte le celle di diffusione verranno salvate come foglio di calcolo di Excel nella cartella di destinazione. L'area della cella viene calcolata come:
        figure-protocol-1 
        La circolarità cellulare è una misura di quanto una cellula sia vicina a una cella perfettamente rotonda. È calcolato come:
        figure-protocol-2 
        dove A e P sono rispettivamente l'area cellulare e il perimetro cellulare. Le proporzioni della cella rappresentano l'allungamento della cellula. Una cellula di diffusione dovrebbe avere proporzioni vicine a 1. Le proporzioni sono calcolate come:
        figure-protocol-3 
      3. Salva contorni: salva le immagini sovrapposte al contorno del contorno della cella nella cartella di destinazione.
    7. Specificare le impostazioni di segmentazione
      1. Mostra segmentazione: mostra il risultato della segmentazione nella console Spyder durante il processo di analisi.
      2. Area cellulare più piccola (μm2): immettereil valore minimo per l'area cellulare, inclusi i valori di area delle celle nelle fasi iniziali dell'attacco. Gli oggetti con un'area inferiore a questa soglia non verranno considerati come celle di diffusione. Questo numero influenzerà il processo di segmentazione.
    8. Specificare i parametri dell'immagine.
      1. Intervallo di acquisizione: immettere la frequenza dell'acquisizione dell'immagine in secondi.
      2. Dimensione pixel (μm): immettere la dimensione dei pixel registrata durante la preparazione delle immagini per l'analisi.
      3. Profondità del bit dell'immagine: immettere la profondità di bit della fotocamera/rilevatore.
    9. Fare clic su Esegui. Se si verifica un errore, nella console di Spyder verrà visualizzato un messaggio di errore. In caso contrario, il processo di analisi delle immagini verrà visualizzato nella console.
      NOTA: la prima immagine visualizzata nella sezione console/grafici (a seconda delle impostazioni di Spyder) mostra tutte le celle identificate nel campo visivo. Le caselle verdi posizionate intorno alle celle indicano celle di diffusione adatte alla segmentazione e all'analisi. Le caselle grigie indicano celle non adatte all'analisi. Il numero totale di celle di diffusione identificate verrà visualizzato anche nella scheda Console. Il software traccia l'area cellulare (in blu) e la circolarità cellulare (in rosso) in funzione del tempo. Questi grafici consentono agli utenti di valutare l'accuratezza della segmentazione cellulare. Una segmentazione riuscita produce una curva monotonamente crescente per l'area cellulare. Per ottenere una curva rappresentativa dell'area di diffusione cellulare, la fase di ritardo deve essere rimossa manualmente dal grafico. La fase di ritardo include misurazioni dell'area cellulare prima che la cellula inizi a diffondersi. La fase di ritardo è indicata da fluttuazioni veloci, rappresentate nel grafico dell'area cellulare(figura 3C a destra).

6. Quantificare la dinamica del bordo cellulare durante la diffusione cellulare utilizzando i cimografi

  1. Prima di eseguire l'analisi, ritagliare i filmati grezzi delle cellule di diffusione per creare serie temporali di singole cellule di diffusione.
    1. Utilizzare lo strumento Rettangolo nella barra degli strumenti Fiji per selezionare manualmente un'area di interesse (ROI) che incapsula una singola cella. Per assicurarsi che il ROI incapsula completamente la cella di diffusione, utilizzare la funzione di scorrimento per ispezionare il ROI in tutti i punti di tempo.
    2. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul ROI e scegliere Duplica.
    3. Selezionare Stack duplicato e fare clic su OK.
  2. Aprire lo script di analisi principale "cell_spreading_GUI.py" selezionando il pulsante Apri file nella barra degli strumenti di Spyder o utilizzando il collegamento CTRL+O. Se la GUI è già stata aperta, passare direttamente al passaggio 6.3.
  3. Aprire l'interfaccia utente grafica di analisi della diffusione delle celle selezionando Esegui file nel pannello superiore o utilizzando il collegamento F5 (Figura 3B).
  4. Fare clic sulla scheda Generatore e analisi Kymograph.
  5. Usa il pulsante sfoglia per selezionare l'immagine tiff per l'analisi.
    NOTA: i formati di file proprietari, ad esempio nd2, lif, zen, non sono supportati dallo script.
  6. Specificare la cartella di destinazione per salvare i dati di output (maschere e valori delle celle).
  7. Specificare le impostazioni di output.
    1. Esportare i dati: esportare un foglio di calcolo di Excel (.xlsx) nella cartella di destinazione contenente le posizioni relative del bordo delle celle e gli eventi di retrazione dei cimografi.
  8. Specificare i parametri dell'immagine:
    1. Intervallo di acquisizione: immettere la frequenza di acquisizione dell'immagine in secondi.
    2. Dimensione pixel (μm): immettere la dimensione dei pixel registrata durante la preparazione delle immagini per l'analisi nel passaggio 5.1.3.
    3. Area cellulare più piccola (μm2): immettereil valore minimo per l'area cellulare, inclusi i valori di area delle celle nelle fasi iniziali dell'attacco. Gli oggetti con un'area inferiore a questa soglia non verranno considerati come celle di diffusione. Questo numero influenzerà il processo di segmentazione.
    4. Profondità del bit dell'immagine: immettere la profondità di bit della fotocamera/rilevatore.
  9. Fare clic su Esegui. Se si verifica un errore, nella console di Spyder verrà visualizzato un messaggio di errore. In caso contrario, nella console verrà visualizzato un riepilogo delle quantificazioni delle dinamiche di protrusione. Ci saranno 4 coppie di misurazioni della frequenza di retrazione e della velocità di protrusione, che vengono estratte da 4 cimografi generati dalle parti superiore, inferiore, sinistra e destra della cella. La frequenza di retrazione è calcolata come:
    figure-protocol-4 
    NOTA: Questo numero dimostra la frequenza con cui il lamellipodio si ritrae nel corso della diffusione. La velocità media di protrusione è misurata dalla pendenza tra l'inizio della sporgenza e il punto di plateau sul cimografo. Una figura kymografica di riepilogo verrà mostrata nella console dopo la segmentazione. Per salvare la figura di riepilogo, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla figura e salvare l'immagine.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo di cui sopra descrive le procedure sperimentali per l'imaging a cellule vive di cellule di diffusione e uno strumento computazionale per l'analisi quantitativa della dinamica di diffusione cellulare. Lo strumento computazionale può essere utilizzato in un formato a bassa o alta produttività per identificare i lettori molecolari che regolano i macchinari di polimerizzazione dell'actina all'avanguardia cellulare.

La rappresentazione schematica delle procedure sperimentali è illustr...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazione...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% tripsina (0,05%), 0,53 mM EDTAWisent Bioproducts325-042-CL
Piastra di Petri da 10,0 cm, polistirene, trattato TC, ventilatoStarstedt83.3902
Provetta da centrifuga in PP ad alta trasparenza da 15 mL, fondo conico, con tappo a vite con chiusura a cupola,Falconsterile 352097
Chamlide CMS a 1 pozzetto per vetrino coprioggetti da 22 mm x 22 mmQuorum TechnologiesCM-S22-1
Piatto per coltura cellulare da 35 mm con trattamento TC Easy-Grip Falcon
Provetta da centrifuga da 50 mL, trasparente, con chiusura a tappoNest602002
Piastre per colture cellulari da 6,0 cm trattate per un maggiore attaccamento cellulare, sterileVWR10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666Millipore Sigma182515
Camera, Prime 95B-25MMFotometrico
Dimetil solfossido, sterileBioShopDMS666
DMEM, 1x, 4,5 g/L di glucosio, con L-glutammina, piruvato di sodio e rosso fenoloWisent Bioproducts319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, senza fenolo rossoGibco11039021
D-PBS, 1XWisent Bioproducts311-425 CL
Siero fetale bovinoWisent Bioproducts080-110
Fiji SoftwareImageJ
HEPES (1 M)Gibco15630080
Plasma umano Fibronectina Proteina purificata 1 mgMillipore SigmaFC010
Olio da immersioneCargille16241
Soluzione di L-glutammina (200 mM)Wisent Bioproducts609-065-EL
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X)Gibco11140050
Micro, quadrati, n. 11/2 22 x 22 mmVWRCA48366-227-1
, obiettivo Eclipse Ti2-ENikon
, olio CFI Plan Apo Lambda 60XNikonMRD01605
Penicillina-StreptomicinaSigmaP4333
Disco rotante, Crest Light V2CrestOptics
SpyderAnaconda
Stage top incubatoreTokai Hit
Statistics Software,Prism GraphPad
, stile 2Microscopia elettronicaScienze 78326-42
353001 Occhiali di copertura Corpo del microscopio pinzette

Riferimenti

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