Qui, presentiamo e valutiamo un protocollo per la realizzazione di colonne per cromatografia liquida a nanoflusso a fase inversa a basso costo per la caratterizzazione dei peptidi utilizzando flussi di lavoro proteomici LC-MS/MS.
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Articolo metodologico
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Qui, presentiamo e valutiamo un protocollo per la realizzazione di colonne per cromatografia liquida a nanoflusso a fase inversa a basso costo per la caratterizzazione dei peptidi utilizzando flussi di lavoro proteomici LC-MS/MS.
L'elevata complessità prevalente nei campioni biologici richiede separazioni cromatografiche con elevata sensibilità e risoluzione per essere analizzate in modo efficace. Qui presentiamo un protocollo robusto, riproducibile ed economico per la preparazione di colonne per cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa a nanoflusso (RP-HPLC) per la separazione in linea di peptidi analitici prima dell'introduzione e del rilevamento da parte di uno spettrometro di massa nei tradizionali flussi di lavoro di proteomica bottom-up. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento e delle proprietà chimiche degli analiti da separare, i parametri ottimali della colonna possono differire per diametro interno o esterno, lunghezza, dimensione delle particelle, dimensione dei pori, chimica delle particelle in fase stazionaria e presenza o assenza di un emettitore elettrospray integrato sulla punta. Un sistema di impaccamento interno non solo consente la fabbricazione rapida di colonne con le proprietà desiderate, ma riduce anche drasticamente i costi del processo. Il protocollo ottimizzato per il confezionamento di una colonna di silice fusa C18 AQ (acquosa) qui discusso è compatibile con un'ampia gamma di strumenti cromatografici liquidi per ottenere una separazione efficace degli analiti.
Le colonne HPLC hanno contribuito enormemente alla produttività nei settori della ricerca farmaceutica, medica e ambientale 1,2,3,4. L'accesso a colonne cromatografiche di alta qualità è un passaggio fondamentale nel frazionamento di analiti complessi. Nella proteomica shotgun, l'elevata sensibilità analitica viene regolarmente raggiunta accoppiando la spettrometria di massa (MS) a ionizzazione elettrospray (ESI) alla cromatografia a nanoflusso 5,6,7,8.
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1. Preparazione della punta capillare
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Per valutare le prestazioni delle colonne, 750 ng di digesti di peptidi triptici preparati da lisati di cellule intere di cellule HEK293 sono stati frazionati online utilizzando un capillare di silice fusa ID lungo 25 cm e 75 μm impacchettato internamente con particelle di ReproSil-Pur 120 C18-AQ sfuse, come descritto nel protocollo. Prima del caricamento del campione, la colonna è stata lavata utilizzando 6 μl di una miscela di acetonitrile, isopropanolo e H2O in un rapporto di 6:2:2 e pre-bilanciata con il t.......
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Le moderne strategie proteomiche si basano su separazioni cromatografiche di alta qualità per analizzare efficacemente sistemi biologici complessi. Pertanto, le colonne LC a nanoflusso ad alte prestazioni ed economiche sono componenti cruciali di un regime di spettrometria di massa tandem di successo volto a caratterizzare migliaia di proteine in un unico flusso di lavoro.
In questo studio abbiamo valutato le prestazioni e l'affidabilità di una gamma di colonn.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione del National Institutes of Health GM089778 a J.A.W.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 99,99% acido formamidico | Sigma-Aldrich | per la produzione | |
| di lampade ad alcool | Qualsiasi marca | Per fornire calore | |
| Cella a pressione di elio Brechbuehler | BioSurplus | per colonna di imballaggio | |
| Taglierina a colonna in ceramica | Qualsiasi marca | per il taglio di silice capillare | |
| Dimetil solfossido (DMSO) ≥ 99% | Sigma-Aldrich | Conservato in un armadio infiammabile | |
| Formamide ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | per la produzione di fritte | |
| Acido fluoridrico (HF) (50%) | Fisher Scientific | per l'apertura dell'emettitore dopo la polimerizzazione | |
| KASIL (Potassium Silicate Solution) | PQ Corporation | per la produzione di fritte | |
| Orbitrap Fusion Lumos | Thermo Fisher Scientific | per l'acquisizione dati MS | |
| P2000 Laser Puller | Sutter | per tirare capillare | |
| PTFE 1/16" Ghiera 0,4 mm ID (lungo) per raccordo per tubi | Cromato | 214104 | Per l'impostazione della bomba |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1,9 um, 1g | Dr. Masch GmbH | r119.aq.0001 | Lotto 5910 |
| Saldatura | Qualsiasi marca | Per l'avvio della polimerizzazione | |
| Raccordo per tubi in acciaio inossidabile, giunto esagonale, 1/4 in. NPT femmina | Swagelok | SS-4-HCG | per l'impostazione di bombe |
| TSP075375 silice fusa, 75 &; micro; m ID x 360 µ OD | MOLEX/Polymicro | 1068150019 | Per tubi a colonna |
| Ultimate 3000 UHPLC | Dionex | tipo HPLC |
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