I gangliosidi sono glicosfingolipidi contenenti acido sialico che sono particolarmente abbondanti nel cervello. La loro natura anfipatica richiede tecniche di estrazione e purificazione organiche/acquose per garantire un recupero ottimale e analisi accurate. Questo articolo fornisce una panoramica dell'estrazione, della purificazione e dell'analisi della cromatografia su ganglioside su scala analitica e preparativa.
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Articolo metodologico
Estrazione, purificazione e profilatura del ganglioside
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I gangliosidi sono glicosfingolipidi che contengono uno o più residui di acido sialico. Si trovano su tutte le cellule e i tessuti dei vertebrati, ma sono particolarmente abbondanti nel cervello. Espressi principalmente sul foglietto esterno delle membrane plasmatiche delle cellule, modulano le attività delle proteine di superficie cellulare tramite associazione laterale, agiscono come recettori nelle interazioni cellula-cellula e sono bersagli per agenti patogeni e tossine. La disregolazione genetica della biosintesi dei gangliosidi nell'uomo provoca gravi disturbi congeniti del sistema nervoso. A causa della loro natura anfipatica, l'estrazione, la purificazione e l'analisi dei gangliosidi richiedono tecniche che sono state ottimizzate da molti ricercatori negli 80 anni dalla loro scoperta. Qui descriviamo i metodi a livello di banco per l'estrazione, la purificazione e le analisi qualitative e quantitative preliminari dei principali gangliosidi da tessuti e cellule che possono essere completati in poche ore. Descriviamo anche metodi per l'isolamento e la purificazione su larga scala delle principali specie di ganglioside dal cervello. Insieme, questi metodi forniscono accesso analitico e su scala preparativa a questa classe di molecole bioattive.
Introduzione
I gangliosidi sono definiti come glicosfingolipidi portatori di uno o più residui di acido sialico1. Sono espressi principalmente sulla superficie cellulare con la loro porzione lipidica idrofobica ceramide incorporata nel foglietto esterno della membrana plasmatica e i loro glicani idrofili che si estendono nello spazio extracellulare2. Sebbene ampiamente distribuiti nelle cellule e nei tessuti dei vertebrati, sono particolarmente abbondanti nel cervello dei vertebrati3, dove sono stati scoperti e nominati per la prima volta4.
Le strutture dei g....
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Protocollo
La raccolta dei tessuti è stata eseguita alle condizioni autorizzate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Estrazione del ganglioside su piccola scala e purificazione parziale
ATTENZIONE: Utilizzare un'adeguata ventilazione quando si lavora con solventi volatili e tossici. Evitare la plastica in tutto; i solventi estrarranno componenti chimici da molte materie plastiche che interferiscono con le analisi successive. Il politetrafluoroetilene (PTFE) è un'eccezione; Le chiusure rivestite in PTFE devono essere utilizzate per tappare i flaconcini di stoccaggio in vetro.
- Estrazione
- Pesar....
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Risultati
I metodi descritti nella sezione 1 (piccola scala) forniscono gangliosidi in quantità e purezza sufficienti per la determinazione qualitativa e quantitativa dei principali gangliosidi cerebrali. Il recupero dal cervello del topo è ~ 1 μmol ganglioside per g di peso cerebralmente bagnato (1 nmol / μL) quando preparato come descritto. La risoluzione TLC di 1 μL (1 nmol) utilizzando la sezione 3 fornisce ampio materiale per il rilevamento del resorcinolo e risolve tutti i principali gangliosidi cerebrali come mostrato per t.......
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Discussione
I metodi per l'estrazione e l'isolamento del ganglioside su piccola e grande scala qui riportati non sono unici: ci sono molti diversi approcci di estrazione e purificazione con solvente che forniscono risultati eccellenti12. I metodi riportati qui per la purificazione su piccola scala dal cervello, da Fredman e Svennerholm13, hanno dimostrato di ottimizzare il recupero e hanno dimostrato di essere robusti e diretti per molti anni nel nostro laboratorio. L'isolamento e la p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non rivendicano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione U01CA241953 del National Institutes of Health (NIH). MJP è stato supportato dal Chemistry-Biology Interface Program presso Johns Hopkins (T32GM080189).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cervello bovino, spogliato | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standard | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Flacone in vetro con tappo rivestito in PTFE | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Flacone da centrifuga in vetro | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Provette per coltura in vetro, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | per la raccolta di frazioni HPLC |
| Imbuto separatore in vetro (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Siringa per iniezione - Hamilton 1750 a tenuta di gas 500 & micro; l | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldeide, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Omogeneizzatore Potter-Elvhjem | Fisher Scientific | 08-414-14A | Scegli l'opzione di volume appropriata |
| Reprosil 100 NH2 10µ m 5x4mm colonne di protezione | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μ m, 250 mm x 20 mm Colonna HPLC | Analytics-Shop | Imballaggio personalizzato | altre dimensioni disponibili |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Evaporatore rotante | Buchi | R-300 | |
| Anello di campionamento per iniettore modello 7725 (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Cartuccia corta, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Siringa per macchie - Hamilton 701N 10 &; l | Hamilton | 80300 | |
| Provette da 13 mm di diametro a pareti spesse con tappi rivestiti in PFTE Fisher | Scientific | 14-933A | |
| Fiale filettate da 2 ml con tappi rivestiti in PFTE Fisher | Scientific | 14-955-323 | Per la conservazione di gangliosidi |
| Piastre TLC, HPTLC Gel di silice 60 F254 Multiformato | Fisher Scientific | M1056350001 L'impregnazione | fluorescenza (F254) stabilizza il sorbente spruzzatore |
| di reagenti TLC | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| Camera di funzionamento TLC per piastre da 10 x 10 cm | Camag | 22.5155 | |
| Waring Miscelatore resistente alle esplosioni in acciaio inossidabile da 1 litro | Waring | E8520 |
Riferimenti
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of....
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Ristampe e permessi
