Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV e identificazione degli epitopi delle cellule T CD4 con restrizioni HLA-DR basati su una matrice peptidica

Summary

Sulla base di una matrice peptidica derivata dal virus dell'epatite B (HBV), le risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV potrebbero essere valutate in parallelo con l'identificazione di epitopi di cellule T CD4 specifiche per HBV.

Abstract

Le cellule T CD4 svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'epatite B cronica. Come popolazione cellulare versatile, le cellule T CD4 sono state classificate come sottoinsiemi funzionali distinti in base alle citochine che hanno secreto: ad esempio, IFN-γ per le cellule CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 per le cellule CD4 T helper 2, IL-21 per le cellule helper follicolari CD4 T e IL-17 per le cellule CD4 T helper 17. L'analisi delle cellule T CD4 specifiche del virus dell'epatite B (HBV) sulla base della secrezione di citochine dopo la stimolazione dei peptidi derivati dall'HBV potrebbe fornire informazioni non solo sull'entità della risposta delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV, ma anche sui sottoinsiemi funzionali delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Nuovi approcci, come la trascrittomica e l'analisi metabolomica, potrebbero fornire informazioni funzionali più dettagliate sulle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Questi approcci di solito richiedono l'isolamento di cellule T CD4 vitali specifiche per HBV basate su multimeri del complesso II di istocompatibilità peptidico-maggiore, mentre attualmente le informazioni sugli epitopi delle cellule T CD4 specifiche per HBV sono limitate. Sulla base di una matrice peptidica derivata dall'HBV, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per l'HBV e identificare gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV utilizzando contemporaneamente campioni di cellule mononucleate del sangue periferico da pazienti con infezione cronica da HBV.

Introduction

Attualmente, ci sono 3 approcci principali per analizzare le cellule T antigene-specifiche. Il primo approccio si basa sull'interazione tra il recettore delle cellule T e il peptide (epitopo). Le cellule T antigene-specifiche potrebbero essere direttamente colorate con multimeri del complesso di istocompatibilità peptidico maggiore (MHC). Il vantaggio di questo metodo è che potrebbe ottenere cellule T antigene-specifiche vitali, adatte per l'analisi trascrittomica/metabolomica a valle. Una limitazione di questo metodo è che non potrebbe fornire informazioni sull'intera risposta delle cellule T a un antigene specifico, in quanto richiede peptidi epitopi convalidati mentre il numero di epitopi identificati per un antigene specifico è limitato per ora. Rispetto agli epitopi delle cellule T CD8 specifici del virus dell'epatite B (HBV), sono stati identificati meno epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV^1,2,il che ha reso questo metodo meno applicabile per l'analisi delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV attualmente.

Il secondo approccio si basa sulla sovraregolazione di una serie di marcatori indotti dall'attivazione dopo stimolazione peptidica antigenica³. I marcatori comunemente usati includono CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB⁴. Questo metodo è stato ora utilizzato per analizzare le risposte antigene-specifiche delle cellule T in individui vaccinati^{5,6, pazienti}con infezione da virus dell'immunodeficienza umana 7 e^pazienticon infezione da sindrome respiratoria acuta grave da Coronavirus^{2 8,9.} A differenza del test basato su multimeri peptidi-MHC, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati e potrebbe ottenere cellule vitali per l'analisi a valle. Una limitazione di questo metodo è che non è stato in grado di fornire informazioni sul profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. Inoltre, l'espressione di questi marcatori indotti dall'attivazione da parte di alcune cellule non specifiche dell'antigene attivato potrebbe contribuire ai segnali di fondo in analisi, il che potrebbe essere un problema soprattutto quando le cellule T antigene-specifiche target sono rare. Attualmente, c'è un'applicazione limitata di questo metodo sulle cellule T CD4 specifiche per HBV⁴. Se questo metodo possa essere utilizzato per analizzare le cellule T CD4 specifiche dell'HBV in modo affidabile richiede ulteriori indagini.

Il terzo approccio si basa sulla secrezione di citochine dopo la stimolazione del peptide antigenico. Come l'analisi basata su marcatori indotta dall'attivazione, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati. Questo metodo potrebbe rivelare direttamente il profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. La sensibilità di questo metodo è inferiore al metodo basato su marcatori indotti dall'attivazione in quanto si basa sulla secrezione di citochine di cellule T antigene-specifiche e il numero di citochine testate è solitamente limitato. Attualmente, questo metodo è ampiamente utilizzato nell'analisi delle cellule T HBV-specifiche. Poiché le cellule T hbV-specifiche secernenti citochine difficilmente potrebbero essere rilevate mediante stimolazione peptidica diretta ex vivo^10,11,il profilo delle citochine delle cellule T HBV-specifiche viene solitamente analizzato dopo 10 giorni di espansione stimolata dal peptide in vitro^{12,13,14,15,16.} La disposizione dei pool peptidici in forma di matrice è stata utilizzata per facilitare l'identificazione degli epitopi antigene-specifici^17,18. Con la combinazione di matrice peptidica e analisi della secrezione di citochine, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per HBV e identificare contemporaneamente gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV¹⁶. In questo protocollo, vengono descritti i dettagli di questo metodo. L'antigene centrale HBV viene scelto come esempio di dimostrazione in questo protocollo.

Protocol

Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente incluso nello studio. Il protocollo di studio è conforme alle linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975, come riflesso nell'approvazione a priori da parte del comitato etico medico del Southwest Hospital.

1. Progettazione della matrice peptidica derivata dall'HBV

1. Scarica le sequenze aminoacidiche dell'antigene del nucleo HBV dai database NCBI (GenBank: AFY98989.1).
2. Acquista peptidi derivati dall'antigene centrale HBV (un pannello di 35 peptidi 15-mer sovrapposti da 10 residui, purezza > 90%, 4 mg / peptide) da un fornitore di servizi di sintesi peptidica.
3. Impostare una matrice peptidica quadrata 6×6 con ogni posizione nella matrice contenente solo 1 peptide. Ci sono 12 pool di peptidi: 6 pool di peptidi di fila e 6 pool di peptidi a colonna, 5-6 peptidi in ogni pool¹⁶. I pool peptidici di riga e i pool peptidici di colonna nella matrice rappresentano 2 formazioni separate di antigene centrale HBV.
4. Per 3/4 dei peptidi acquistati, mescolare i peptidi nella stessa riga / colonna della matrice in 12 pool peptidici separati sciogliendoli insieme in dimetilsolfossido (DMSO) (2 μg / μL per ciascun peptide). Conservare a -80 °C per l'analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV.
5. Sciogliere il resto dei peptidi separatamente (10 μg/μL) e conservare a -80 °C per l'identificazione dell'epitopo.

2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

1. Campione di 5 ml di sangue venoso da pazienti con infezione cronica da HBV.
   NOTA: Il volume del sangue deve essere approssimativamente stimato in base al numero di pool peptidici più 1 controllo di fondo e 1 controllo positivo. L'analisi di 1 pool peptidico richiede 3 x^{10 5} PBMC. In media, 1 x 10⁶ PBMC potrebbero essere ottenuti da 1 mL di sangue.
2. Isolare i PBMC dal sangue utilizzando la centrifugazione con gradiente di densità Ficoll (800 × g, 20 min) e crioconservare PBMC isolati in azoto liquido per un uso successivo.
3. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere i granulociti tra lo strato chiaro di Ficoll e lo strato di globuli rossi. Estrarre il DNA genomico dai granulociti utilizzando un kit di purificazione del DNA genomico secondo il protocollo del produttore.
4. Inviare il campione di DNA ai fornitori di servizi di genotipizzazione per determinare il genotipo HLA-DRB1.

3. Espansione in vitro di PBMC utilizzando una matrice peptidica HBV

1. Scongelare i PBMC.
   1. RPMI 1640 caldo integrato con 1:10.000 benzonasi (25 U/mL) a 37 °C a bagnomaria.
      NOTA: La benzonasi aiuta a limitare l'aggregazione cellulare durante lo scongelamento. Ogni campione richiederà 20 ml di RPMI 1640 con benzonasi. Calcolare la quantità necessaria per scongelare tutti i campioni e preparare un'aliquota separata di mezzi (37 °C) con 1:10.000 benzonasi (25 U/mL). Scongelare non più di 5 campioni alla volta.
   2. Rimuovere i campioni dall'azoto liquido e scongelare rapidamente i flaconcini congelati a bagnomaria (37 °C).
   3. Trasferire la sospensione cellulare scongelata in un tubo centrifugo da 15 ml. Aggiungere 1 mL di benzonasi RPMI 1640 (37 °C) a goccia al tubo. Aggiungere lentamente 6 mL di Benzonasi RPMI 1640 (37 °C) al tubo della centrifuga, sciacquare crioviale con altri 2 mL di Benzonasi RPMI 1640 (37 °C) per recuperare tutte le cellule. Continuare con il resto dei campioni il più rapidamente possibile.
      NOTA: La lenta diluizione dei campioni crioconservati è la chiave per mantenere la vitalità delle cellule scongelate.
   4. Centrifugare (400 × g, 10 min), rimuovere il surnatante e allentare il pellet picchiettando il tubo.
   5. Riaspentare delicatamente il pellet in 1 mL di benzonasi calda RPMI 1640. Mescolare delicatamente e filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 70 μm, se necessario (cioè se esiste un grumo visibile).
   6. Aliquotare una sospensione di 10 μL e diluire nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), aggiungere il blu di Tripano (0,04%), caricare su un emocitometro, attendere 1 minuto e contare il numero di cellule vitali (cellule chiare).
   7. Aggiungere 9 mL di benzonasi RPMI 1640 (37 °C) al tubo, centrifugare (400 × g, 10 min), rimuovere il surnatante e allentare il pellet picchiettando il tubo.
2. PBMC risospesi in RPMI 1640 integrati con 25 mM HEPES, 2 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10% di siero AB umano (terreno di coltura completo). Regolare la densità della cella a 1,5 x^{10 6} celle/ml. PBMC a piastre a piastra in piastre a 96 pozzetti (fondo piatto) ad una densità di 3 x 10⁵ celle/pozzettino.
3. Aggiungere pool peptidici derivati dall'HBV (2 μg/mL per ogni singolo peptide) a ciascun pozzetti. Per i pozzi di controllo di fondo e controllo positivo, aggiungere la stessa quantità di solvente (DMSO, 1 μL/mL). Aggiungere 10 U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Incubare a 37 °C e 5% CO₂.
4. Al giorno 3, integrare il terreno di coltura con 50 U/ mL di IL-2 e 10 ng / mL di IL-7.
   NOTA: Durante il giorno 1 al giorno 3, non si osserverà un'evidente proliferazione delle cellule T. Il numero totale di cellule di solito diminuisce da 1/3 a 1/2, a causa della morte di cellule non T come cellule B, cellule NK, cellule NKT e monociti.
5. Al giorno 7, sostituire metà del terreno di coltura con un mezzo fresco contenente peptidi (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) e IL-7 (20 ng/mL).
   NOTA: Per evitare di disturbare le cellule nella parte inferiore, pipettare con attenzione circa 90 μL di terreno di coltura dalla parte superiore del mezzo. Durante il giorno 3 al giorno 7, si osserverà una robusta proliferazione delle cellule T e le cellule T proliferanti di solito si aggregano per formare cluster.
6. Al giorno 10, pipettare delicatamente la coltura cellulare in ciascun pozzetti 7-9 volte per disaggregare i cluster cellulari, contare il numero di cellule vitali e trasferire 2×10⁵ cellule in ciascun pozzetti in una piastra a 96 pozzetti (fondo rotondo) per l'analisi della risposta delle cellule T CD4 specifiche per HBV.
7. Continuare a coltivare il resto delle cellule per l'identificazione dell'epitopo al giorno 12, regolare il volume del terreno di coltura a 100 μL (scartando il mezzo eccessivo) e integrare la coltura con 100 μL di terreno di coltura completo fresco contenente peptidi (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) e IL-7 (20 ng / mL).
   NOTA: Durante il giorno 7 al giorno 10, le cellule T continuano a proliferare vigorosamente. Sostituire il terreno di coltura come nel passaggio 3.5 se il mezzo diventa giallo. In generale, il numero di cellulare supererà 6×10⁵ al giorno 10. Ogni pozzo di solito mostra un numero di cella simile, conta il numero di celle in 3 pozzi e usa il valore medio come stima del numero di celle per tutti i pozzi.

4. Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV mediante citometria a flusso intracellulare

1. PBMC stimolanti con pool peptidici
   1. Per le celle trasferite alla piastra a 96 pozzetti (fondo rotondo), lavare 3 volte in una piastra (550 × g, 3 min). Utilizzare 200 μL di terreno per ogni lavaggio (RPMI 1640 per i primi 2 lavaggi, terreno di coltura completo per l'ultimo lavaggio). Scartare i supernatanti.
      NOTA: La rimozione delle citochine residue nella coltura mediante lavaggio ripetuto potrebbe ridurre efficacemente il background nell'analisi citometrica a flusso intracellulare.
   2. Per ogni pozzettino di cellule stimolate con uno specifico pool peptidico, aggiungere 200 μL di terreno di coltura completo integrato con gli stessi pool peptidici (2 μg/mL per ogni singolo peptide). Per il pozzo di controllo dello sfondo, aggiungere un terreno di coltura completo integrato con 1 μL/mL di DMSO. Per il pozzo di controllo positivo, aggiungere un terreno di coltura completo integrato con 1 μL / mL di DMSO, 150 ng / mL di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μmol / L di ionomicina.
      NOTA: Alte dosi di DMSO bloccheranno la secrezione di citochine delle cellule T (più significativa per il TNF-α). La dose di DMSO superiore a 5 μL/mL non è raccomandata. Generalmente, la dose di DMSO nel nostro esperimento non supera 1 μL / mL.
   3. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 6 ore.
   4. Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere Monensin (1,37 μg/mL) alla coltura.
2. Citometria a flusso
   1. Dopo 6 ore di incubazione. Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione (550 × g, 3 min), lavare le celle una volta con 200 μL di DPBS (550 × g, 3 min), marcatori di superficie (CD3, CD4 e CD8) e marcatore di vitalità (utilizzando Fixable Viability Dye) in frigorifero a 4 °C per 30 min.
   2. Lavare una volta con 200 μL di DPBS (550 × g, 3 min). Fissare e permeabilizzare le cellule e macchiare le citochine intracellulari (TNF-α e IFN-γ) in frigorifero a 4 °C per 45 min.
   3. Dopo il lavaggio finale nella colorazione intracellulare, risusependare le cellule in 150 μL di tampone citometrico a flusso (DPBS + 0,5% BSA).
   4. Acquisire dati di citometria a flusso su un citometro a flusso.
3. Analisi dei risultati della citometria a flusso
   1. Definizione di pozzo positivo: considerare un bene come positivo se ha una frequenza di citochine che secernono cellule T almeno due volte del pozzo di controllo di fondo (Figura 1).
   2. Secondo la seguente formula, calcolare il tasso di risposta per ogni citochina analizzata (Figura 2):
      
      NOTA: Il pool peptidico di riga e i pool peptidici di colonna nella matrice rappresentano 2 formazioni distinte di antigene del nucleo dell'HBV, quindi il tasso di risposta finale deve essere diviso per 2.

5. Identificazione degli epitopi a cellule T CD4 con HLA-DR Restricted HV-specific

1. Scongelare e mantenere le linee cellulari linfoblastoidi B allogeniche (GLCL) nel matraccio T-75 (5-20 ×10⁶ cellule, 20 ml di terreno di coltura completo).
   NOTA: Per garantire il buono stato dei GLCL, questa fase deve essere iniziata 2 settimane prima dello scongelamento delle PBMC dei pazienti. Le BCLC devono essere omozigoti nell'allele HLA-DRB1. Secondo il risultato della genotipizzazione, i pazienti devono condividere lo stesso allele HLA-DRB1 dei GLCL.
2. Screening dei peptidi candidati per l'identificazione (Figura 3)
   1. Secondo i risultati del tasso di risposta delle cellule T al giorno 10, escludere 2 pool di peptidi con il più alto tasso di risposta (pool peptidico a 1 riga e pool peptidico a 1 colonna).
   2. Impostare il peptide in quei 2 pool come peptide candidato se anche l'altro pool peptidico contenente questo peptide mostra un risultato positivo nell'analisi della risposta delle cellule T. Utilizzare i PBMC espansi con l'altro pool peptidico per l'identificazione dell'epitopo in un secondo momento.
3. GLCL pulsanti con peptide
   1. Al giorno 12, contare il numero di GLCL vitali, trasferire le celle in tubi centrifughi da 15 ml, centrifugare (350 × g, 10 min) e rimuovere il surnatante. Risuscisciare il pellet cellulare in un terreno di coltura completo e aliquotal in una piastra a 96 pozzetti (fondo tondo) a 4×10⁴ celle / pozzetti in un terreno di coltura completo da 80 μL.
   2. Aggiungere un singolo peptide (10 μg/mL), incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 2 ore. Set 2 controllo di fondo: pulsazione peptidica con blocco HLA-DR (pretrattamento con anti-HLA-DR (10 μg/mL) per 1 h); DMSO (1 μL/mL) pulsante. Il volume finale del terreno di coltura completo in ciascun pozzo è di 100 μL.
   3. Aggiungere mitomicina C (100 μg/mL), incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 1 ora.
   4. Lavare 3 volte con 200 μL di RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in una piastra per rimuovere il peptide non pulsato e la mitomicina C. Per il primo lavaggio, integrare la coltura di incubazione con 100 μL di RPMI 1640.
   5. Cellule di ripresa in 120 μL di terreno di coltura completo.
4. PBMC stimolanti con GLCL pulsati peptidici.
   1. Al giorno 12, trasferire i PBMC su una piastra a 96 pozzetti (fondo tondo).
   2. Rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione (550 × g, 3 min) in un piatto, un lavaggio due volte con 200 μL di RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in una piastra.
      NOTA: La rimozione di citochine e peptidi residui in coltura mediante lavaggio ripetuto è il passo chiave per ridurre il background nell'analisi della citometria a flusso intracellulare. Soprattutto per i peptidi residui, si legherà ai GLCL e aumenterà significativamente lo sfondo.
   3. Sospend PBMC in ogni pozzo con 210 μL di terreno di coltura completo.
   4. Per il pozzo di PBMC scelto per l'identificazione degli epitopi, mescolare l'aliquota (70 μL ciascuna) con GLCL pulsati peptidici (3 pozzetti, inclusi 2 controlli di fondo).
      NOTA: Al giorno 12, il numero di POOL peptidici espansi PBMC di solito raggiunge oltre 5-7×10⁵ per pozzetti, quindi il rapporto tra PBMC / BLCL è di circa 6/1 a 4/1.
   5. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 6 ore.
   6. Dopo 1 ora di incubazione, aggiungere Monensin (1,37 μg/mL) alla coltura. Il volume finale del terreno di coltura completo in ciascun pozzo è di 200 μL.
5. Citometria a flusso
   1. Ripetere le stesse operazioni del passaggio 4.2.
6. Analisi dei risultati della citometria a flusso
   1. Verificare un peptide come epitopo delle cellule T CD4 limitato HLA-DR se le PBMC incubate con questo peptide pulsato BLCL mostrano una frequenza di cellule T CD4 secernenti citochine almeno due volte delle PBMC incubate con controlli di fondo (peptide pulsante con pre-blocco HLA-DR; DMSO pulsante) (Figura 4).

Results

La frequenza delle cellule T CD4 che secernono citochine è calcolata come la somma sia dei singoli produttori che dei doppi produttori. Come dimostrato nella Figura 1, la frequenza delle cellule T4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ nel controllo di fondo (DMSO) sono rispettivamente dello 0,154% e dello 0,013%. La frequenza delle cellule T CD4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ specifiche per il pool peptidico Core11 sono ri...

Discussion

I passaggi più critici in questo protocollo sono elencati come segue: 1) abbastanza PBMC di alta redditività per avviare l'espansione dei PBMC; 2) ambiente appropriato per l'espansione dei PBMC; e 3) rimozione completa dei pool peptidici residui nella coltura di PBMC prima dell'identificazione dell'epitopo.

Tutte le analisi in questo protocollo dipendono dalla robusta proliferazione delle cellule T CD4. In generale, il numero di PBMC dopo l'espansione di 10 giorni sarà 2-3 volte superiore al n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina Bovina V (BSA)	Beyotime	ST023
Coniugato con APC Anti-umano TNF-&alfa;	eBioscience	17-7349-82	Proteggere dalla luce
Benzonasi Nucleasi	Sigma-Aldrich	E1014	Limitare le
linee cellulari linfoblastoidi B (BLCL)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*0803 linee cellulari linfoblastoidi omozigoti
B (BLL)	FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER		HLA-DRB1*1202 omozigote
Pallone per colture cellulari (T75)	Piastra	Corning 430641
(96 pozzetti, fondo piatto)	Corning	3599	fondo piatto
(96 pozzetti, fondo rotondo)	Corning	3799	fondo tondo
	Corning	CLS431751	Dimensione dei pori 70  μ m, bianco, sterile
Provetta da centrifuga (15 mL)	KIRGEN	KG2611	Provetta da
centrifuga sterile (50 mL)	Corning	430829	Centrifuga sterile
Eppendorf	5804R		refrigerata
Thermo	ST16R		refrigerata
, Thermo		Legend Micro 21R
refrigerataKit Cytofix/Cytoperm (Set di tamponi per fattori di trascrizione)	BD Biosciences	562574	Preparare la soluzione prima dell'uso
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Conservare a temperatura ambiente per evitare la cristallizzazione
Dulbecco' s Soluzione salina			ddH2O (1000 ml) contenente NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) e Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Regolare il PH a 7,4. Sterilizzare in autoclave.
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-03
Puntali filtranti (0,5-10)	Kirgen	KG5131	Puntali filtranti sterili
(100-1000)	Kirgen	KG5333	Puntali filtranti sterili
(1-200)	Kirgen	KG5233	Sterili
CD4 bioLegend anti-coniugati FITC		300506	Conservare al riparo dalla luce
Colorante di vitalità fissabile eFluor780	eBioscience	65-0865-14	Proteggere dalla luce
Inibitore del trasporto proteico GolgiStop (contenente monensina)	554724	inibitore del trasporto proteico	Biosciences
	Marca	718620
Peptidi derivati dall'antigene centrale HBV	ChinaPeptides
HEPES	Gibco	15630080	100 ml
Siero Umano AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 ml
Ionomicina	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa Citometro a Flusso	BD
L-glutammina	Gibco	25030081	da 100 ml
(1,5 mL)	Corning	MCT-150-C	Sterilizzazione in autoclave prima dell'utilizzo
agitatori per micropiastre	Scientific Industries	MicroPlate Genie
Mitomicina C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
Provette per PCR (0,2 mL)	Kirgen	KG2331
PE/Cy7-coniugato Anti-umano	CD8 BioLegend	300914	Proteggere dalla luce
PE-coniugato Anti-umano IFN-γ	eBioscience	12-7319-42	Proteggere dalla luce
Penicillina Streptomicina	Gibco	15140122	100 ml
PerCP-Cy5.5-coniugato Anti-umano CD3	eBioscience	45-0037-42	Proteggere dalla luce
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
Ricombinante Umano IL-2	PeproTech	200-02
IL-7 umano ricombinante	PeproTech	200-07
RPMI medio 1640	Gibco	C11875500BT	500 ml
piruvato di sodio, 100mM	Gibco	15360070
tripano colorazione blu (0,4%)	Gibco	15250-061
Ultra-LEAF purificato HLA-DR anti-umano	BioLegend	307648
Wizard DNA genomico Kit di Purificazione	Promega	A1125