Sulla base di una matrice peptidica derivata dal virus dell'epatite B (HBV), le risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV potrebbero essere valutate in parallelo con l'identificazione di epitopi di cellule T CD4 specifiche per HBV.
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Articolo metodologico
Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV e identificazione degli epitopi delle cellule T CD4 con restrizioni HLA-DR basati su una matrice peptidica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T CD4 svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'epatite B cronica. Come popolazione cellulare versatile, le cellule T CD4 sono state classificate come sottoinsiemi funzionali distinti in base alle citochine che hanno secreto: ad esempio, IFN-γ per le cellule CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 per le cellule CD4 T helper 2, IL-21 per le cellule helper follicolari CD4 T e IL-17 per le cellule CD4 T helper 17. L'analisi delle cellule T CD4 specifiche del virus dell'epatite B (HBV) sulla base della secrezione di citochine dopo la stimolazione dei peptidi derivati dall'HBV potrebbe fornire informazioni non solo sull'entità della risposta delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV, ma anche sui sottoinsiemi funzionali delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Nuovi approcci, come la trascrittomica e l'analisi metabolomica, potrebbero fornire informazioni funzionali più dettagliate sulle cellule T CD4 specifiche dell'HBV. Questi approcci di solito richiedono l'isolamento di cellule T CD4 vitali specifiche per HBV basate su multimeri del complesso II di istocompatibilità peptidico-maggiore, mentre attualmente le informazioni sugli epitopi delle cellule T CD4 specifiche per HBV sono limitate. Sulla base di una matrice peptidica derivata dall'HBV, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per l'HBV e identificare gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell'HBV utilizzando contemporaneamente campioni di cellule mononucleate del sangue periferico da pazienti con infezione cronica da HBV.
Introduzione
Attualmente, ci sono 3 approcci principali per analizzare le cellule T antigene-specifiche. Il primo approccio si basa sull'interazione tra il recettore delle cellule T e il peptide (epitopo). Le cellule T antigene-specifiche potrebbero essere direttamente colorate con multimeri del complesso di istocompatibilità peptidico maggiore (MHC). Il vantaggio di questo metodo è che potrebbe ottenere cellule T antigene-specifiche vitali, adatte per l'analisi trascrittomica/metabolomica a valle. Una limitazione di questo metodo è che non potrebbe fornire informazioni sull'intera risposta delle cellule T a un antigene specifico, in quanto richiede peptidi epitopi convalidati men....
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Protocollo
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun paziente incluso nello studio. Il protocollo di studio è conforme alle linee guida etiche della Dichiarazione di Helsinki del 1975, come riflesso nell'approvazione a priori da parte del comitato etico medico del Southwest Hospital.
1. Progettazione della matrice peptidica derivata dall'HBV
- Scarica le sequenze aminoacidiche dell'antigene del nucleo HBV dai database NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- Acquista peptidi derivati dall'antigene centrale HBV (un pannello di 35 peptidi 15-mer sovrapposti da 10 residui, purezza > 90%, 4 mg / peptide) da un fornitore di servizi di ....
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Risultati
La frequenza delle cellule T CD4 che secernono citochine è calcolata come la somma sia dei singoli produttori che dei doppi produttori. Come dimostrato nella Figura 1, la frequenza delle cellule T4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ nel controllo di fondo (DMSO) sono rispettivamente dello 0,154% e dello 0,013%. La frequenza delle cellule T CD4 secernenti TNF-α e la frequenza delle cellule T CD4 secernenti IFN-γ specifiche per il pool peptidico Core11 sono ri.......
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Discussione
I passaggi più critici in questo protocollo sono elencati come segue: 1) abbastanza PBMC di alta redditività per avviare l'espansione dei PBMC; 2) ambiente appropriato per l'espansione dei PBMC; e 3) rimozione completa dei pool peptidici residui nella coltura di PBMC prima dell'identificazione dell'epitopo.
Tutte le analisi in questo protocollo dipendono dalla robusta proliferazione delle cellule T CD4. In generale, il numero di PBMC dopo l'espansione di 10 giorni sarà 2-3 volte superiore al n.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81930061), dalla Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e dalla Chinese Key
Progetto Specializzato in Malattie Infettive (2018ZX10723203).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina Bovina V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| Coniugato con APC Anti-umano TNF-&alfa; | eBioscience | 17-7349-82 | Proteggere dalla luce |
| Benzonasi Nucleasi | Sigma-Aldrich | E1014 | Limitare le |
| linee cellulari linfoblastoidi B (BLCL) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*0803 linee cellulari linfoblastoidi omozigoti | |
| B (BLL) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*1202 omozigote | |
| Pallone per colture cellulari (T75) | Piastra | Corning 430641 | |
| (96 pozzetti, fondo piatto) | Corning | 3599 | fondo piatto |
| (96 pozzetti, fondo rotondo) | Corning | 3799 | fondo tondo |
| Corning | CLS431751 | Dimensione dei pori 70 μ m, bianco, sterile | |
| Provetta da centrifuga (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Provetta da |
| centrifuga sterile (50 mL) | Corning | 430829 | Centrifuga sterile |
| Eppendorf | 5804R | refrigerata | |
| Thermo | ST16R | refrigerata | |
| , Thermo | Legend Micro 21R | ||
| refrigerataKit Cytofix/Cytoperm (Set di tamponi per fattori di trascrizione) | BD Biosciences | 562574 | Preparare la soluzione prima dell'uso |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Conservare a temperatura ambiente per evitare la cristallizzazione |
| Dulbecco' s Soluzione salina | ddH2O (1000 ml) contenente NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) e Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Regolare il PH a 7,4. Sterilizzare in autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Puntali filtranti (0,5-10) | Kirgen | KG5131 | Puntali filtranti sterili |
| (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Puntali filtranti sterili |
| (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterili |
| CD4 bioLegend anti-coniugati FITC | 300506 | Conservare al riparo dalla luce | |
| Colorante di vitalità fissabile eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Proteggere dalla luce |
| Inibitore del trasporto proteico GolgiStop (contenente monensina) | 554724 | inibitore del trasporto proteico | Biosciences |
| Marca | 718620 | ||
| Peptidi derivati dall'antigene centrale HBV | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Siero Umano AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Citometro a Flusso | BD | ||
| L-glutammina | Gibco | 25030081 | da 100 ml |
| (1,5 mL) | Corning | MCT-150-C | Sterilizzazione in autoclave prima dell'utilizzo |
| agitatori per micropiastre | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomicina C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| Provette per PCR (0,2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-coniugato Anti-umano | CD8 BioLegend | 300914 | Proteggere dalla luce |
| PE-coniugato Anti-umano IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Proteggere dalla luce |
| Penicillina Streptomicina | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-coniugato Anti-umano CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Proteggere dalla luce |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Ricombinante Umano IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| IL-7 umano ricombinante | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI medio 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| piruvato di sodio, 100mM | Gibco | 15360070 | |
| tripano colorazione blu (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF purificato HLA-DR anti-umano | BioLegend | 307648 | |
| Wizard DNA genomico Kit di Purificazione | Promega | A1125 |
Riferimenti
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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Ristampe e permessi
