Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

L. Gardini; A. V. Kashchuk; F. S. Pavone; M. Capitanio

doi:10.3791/62388

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Articolo metodologico

Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

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DOI:

10.3791/62388

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1 luglio 2021

L. Gardini¹^,² , A. V. Kashchuk²^,³ , F. S. Pavone¹^,²^,³ , M. Capitanio²^,³

¹National Institute of Optics, National Research Council, ²LENS, European Laboratory for Non-Linear Spectroscopy, ³Physics Department, University of Florence

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Sommario

Presentato qui è un protocollo completo per eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi miosina-5, che potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi. Il protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, all'acquisizione dei dati e all'analisi.

Abstract

La spettroscopia force-clamp ultraveloce (UFFCS) è una tecnica a singola molecola basata su pinzette laser che consente lo studio della chemiomeccanica delle miosine convenzionali e non convenzionali sotto carico con una risoluzione temporale senza precedenti. In particolare, la possibilità di sondare motori di miosina sotto forza costante subito dopo la formazione del legame actina-miosina, insieme all'alto tasso di feedback di forza (200 kHz), ha dimostrato che l'UFFCS è un valido strumento per studiare la dipendenza dal carico di dinamiche veloci come la corsa di lavoro della miosina. Inoltre, UFFCS consente lo studio di come le interazioni miosina-actina processive e non processive sono influenzate dall'intensità e dalla direzione della forza applicata.

Seguendo questo protocollo, sarà possibile eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi di miosina-5 e su una varietà di miosine non convenzionali. Con alcuni aggiustamenti, il protocollo potrebbe anche essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi come chinesine e dineine. Il protocollo comprende tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, alle procedure di taratura, all'acquisizione e all'analisi dei dati.

Introduzione

Negli ultimi decenni le pinzette ottiche sono state un valido strumento per chiarire la meccanochimica delle interazioni proteiche a livello di singola molecola, grazie alla sorprendente possibilità di manipolazione e misurazione simultanea dei cambiamenti conformazionali e della cinetica enzimatica ^1,2. In particolare, la capacità di applicare e misurare forze nell'intervallo di quelle esercitate dai motori molecolari nella cellula, insieme alla capacità di misurare i cambiamenti conformazionali sub-nanometrici, ha reso le pinzette ottiche uno strumento unico a singola molecola per svelare le proprietà chemio....