Colorazione immunofluorescente per la visualizzazione delle proteine associate all'eterocromatina nelle ghiandole salivari della Drosophila

Sommario

Questo protocollo mira a visualizzare gli aggregati di eterocromatina nelle cellule di politene di Drosophila.

Abstract

La visualizzazione degli aggregati di eterocromatina mediante immunosocienza può essere impegnativa. Molti componenti mammiferi della cromatina sono conservati in Drosophila melanogaster. Pertanto, è un modello eccellente per studiare la formazione e la manutenzione dell'eterocromatina. Le cellule politenizzate, come quelle che si trovano nelle ghiandole salivari di larve di terzo instar D. melanogaster, forniscono uno strumento eccellente per osservare la cromatina amplificata quasi mille volte e hanno permesso ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella distribuzione dell'eterocromatina nel nucleo. Sebbene l'osservazione dei componenti dell'eterocromatina possa essere effettuata direttamente nei preparati cromosomici di politene, la localizzazione di alcune proteine può essere alterata dalla gravità del trattamento. Pertanto, la visualizzazione diretta dell'eterocromatina nelle cellule completa questo tipo di studio. In questo protocollo, descriviamo le tecniche di immunostaining utilizzate per questo tessuto, l'uso di anticorpi fluorescenti secondari e la microscopia confocale per osservare questi aggregati di eterocromatina con maggiore precisione e dettaglio.

Introduzione

Fin dai primi studi di Emil Heitz^1,l'eterocromatina è stata considerata un importante regolatore dei processi cellulari come l'espressione genica, la separazione meiotica e mitotica dei cromosomi e il mantenimento della stabilità del^{genoma 2,3,4}.

L'eterocromatina è principalmente divisa in due tipi: l'eterocromatina costitutiva che definisce tipicamente sequenze ripetitive e gli elementi trasponibili presenti in specifici siti cromosomici come i telomeri e i centromeri. Questo tipo di eterocromatina è definito principalmente epigeneticamente da specifici segni istonosi come la di o trimetilazione della lisina 9 dell'istone H3 (H3K9me3) e il legame della proteina eterocromatina 1a (HP1a)^5,6. D'altra parte, l'eterocromatina facultativa si localizza attraverso le braccia del cromosoma e consiste principalmente di geni silenziati per lo^{sviluppo 7,8}. L'immunosottenizione di blocchi di eterocromatina nelle cellule metafase, o l'osservazione di aggregati di eterocromatina nelle cellule interfase, ha svelato molta luce nella comprensione della formazione e della funzione delle regioni eterocromomatiche⁹.

L'uso della Drosophila come sistema modello ha permesso lo sviluppo di strumenti essenziali per studiare l'eterocromatina senza l'uso della microscopia elettronica¹⁰. Dalla descrizione della variegatione dell'effetto posizione e dalla scoperta di proteine associate all'eterocromatina, come HP1a, e modifiche post-trasdutazionali istone, molti gruppi hanno sviluppato diverse tecniche immunoistochimiche che consentono la visualizzazione di queste regioni eterocromomatiche^10,11.

Queste tecniche si basano sull'uso di anticorpi specifici che riconoscono proteine associate all'eterocromatina o segni istonali. Per ogni tipo di cellula e anticorpo, le condizioni di fissazione e permeabilizzazione devono essere determinate empiricamente. Inoltre, le condizioni possono variare se vengono utilizzati ulteriori processi meccanici come le tecniche di squashing. In questo protocollo, descriviamo l'uso delle ghiandole salivari della Drosophila per studiare i focolai eterocromatici. Le ghiandole salivari hanno cellule politenizzate che contengono più di 1.000 copie del genoma, fornendo così una visione amplificata della maggior parte delle caratteristiche della cromatina, ad eccezione del DNA satellitare e di alcune regioni eterocromatiche che sono sotto replicate. Tuttavia, le regioni dell'eterocromatina sono facilmente visualizzabili nei preparati cromosomici del politene, ma le tecniche di schiacciamento possono talvolta interrompere i complessi caratteristici legati alla cromatina o l'architettura della cromatina. Pertanto, l'immunolocalizzazione delle proteine in tutto il tessuto della ghiandola salivare può superare questi effetti indesiderati. Abbiamo utilizzato questo protocollo per rilevare diverse proteine legate alla cromatina, e abbiamo dimostrato che questo protocollo combinato con le scorte mutanti di Drosophila può essere utilizzato per studiare l'interruzione dell'eterocromatina¹².

Protocollo

1. Terza cultura delle larve instar

1. Preparare 1 litro di mezzi standard aggiungendo 100 g di lievito, 100 g di zucchero di canna intero non raffinato, 16 g di agar, 10 mL di acido propionico e 14 g di gelatina. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne il lievito in 800 mL di acqua del rubinetto e quindi sciogliere il lievito. Autoclave immediatamente per 30 minuti.
   1. Successivamente, lasciare raffreddare il supporto a 60 °C e aggiungere acido propionico a una concentrazione finale dello 0,01%. Lasciare riposare la bottiglia fino a formare la gelatina.
2. Per ottimizzare la cultura delle larve 3o instar, raccogli prima adulti di età da 5 a 10 giorni e posiziona 50 (25 maschi e 25 femmine) in un'ampia bottiglia di collo di media standard.
3. Posizionare la bottiglia con le mosche in un incubatore di temperatura controllata a 25 °C fino a quando il numero di uova deposte è 50 (circa 12 ore per il ceppo di tipo selvatico).
4. Al termine del tempo di incubazione, rimuovere gli adulti e trasferirli in una nuova bottiglia per ripetere la procedura. Lasciare crescere gli embrioni a 18 °C per 72 ore
   NOTA: Per ulteriori informazioni sulle condizioni di manutenzione delle scorte di Drosophila, vedere Tennessen & Thymmel¹³.

2. Raccolta delle larve

1. Per la raccolta delle larve scegli le larve errante che non hanno spiracoli estroversi. Dopo l'eversione degli spiracoli, la larva entra nello stadio prepupale, pur mantenendo eccellenti cromosomi di politene adatti all'analisi. Solo dopo 12 ore le cellule della ghiandola salivare iniziano a prepararsi per la morte cellulare programmata^14,15.
2. Prendi quindici larve instar di 3° e mettile in un bicchiere da orologio per lavarle. Quindi trasferirli in una soluzione salina ghiacciata o PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4,2 mM KH₂PO_4,regolare il pH a 7,4).
3. Sezionare da 15 a 30 paia di ghiandole salivari (o il maggior numero possibile in 30 minuti) in PBS freddo con inibitori della proteasi al microscopio stereoscopico. Trasferire le ghiandole salivari in un tubo da 1,5 ml con PBS ghiacciato.
4. Lavare una volta con 1 mL di PBS più inibitori della proteasi. Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.
5. Dopo il lavaggio, rimuovere il PBS con una pipetta da 1000 μL. Fare attenzione a non toccare il tessuto.
   1. In alternativa, sezionare le ghiandole salivari in 5 mL di PBS per eliminare la necessità di questa fase di lavaggio e procedere al passaggio 3 trasferendo le ghiandole salivari a 0,5 mL del tampone di fissaggio Ruvkun descritto di seguito.

3. Fissazione del tessuto della ghiandola salivare

1. Dopo aver rimosso il PBS dall'ultimo passaggio, aggiungere direttamente 0,5 mL di tampone di fissaggio 1x Ruvkun, con 50% di metanolo (aggiungere 0,5 mL di metanolo) e 2% di formaldeide.
   NOTA: 2x La soluzione di Ruvkun è di 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES a pH 7.4.
2. Incubare per 2 ore a 4 °C con una leggera rotazione.

4. Lavaggio del tessuto della ghiandola salivare

1. Effettuare un lavaggio a rotazione di 5 minuti con 1 mL di tampone Tris/Triton (100 mM Tris pH 7.4, 1% Triton X-100 e 1 mM EDTA).
   NOTA: Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.

5. Permeabilizzazione

1. Incubare le ghiandole salivari in 1 mL di Tris/Triton X-100 (lo stesso di cui sopra). Per alcune proteine potrebbe essere necessario aggiungere l'1% β-mercaptoetanolo.
2. Incubare per 2 ore a 37 ° C con lievi scosse (300 giri/min).

6. Passaggio di conservazione (facoltativo)

NOTA: Se non si procede immediatamente all'incubazione con l'anticorpo, conservare il tessuto come segue.

1. Lavare con 1 mL di TAMPONE BO₃ (0,01 M H₃BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH) e quindi incubare in BO₃/10 mM DTT a 37 ° C con scuotimento lieve (300 giri/min) per 15 minuti.
2. Alla fine del periodo di incubazione, eseguire un lavaggio con 1 mL di tampone BO₃ da solo.
   NOTA: Attendere che il tessuto raggiunga il fondo del tubo.
3. Aggiungere 1 mL di PBS. Conservare il tessuto in questa soluzione a 4 °C per un massimo di 72 ore e quindi procedere con il passaggio successivo. Questo passaggio è particolarmente utile quando si lavora con diversi ceppi mutanti che possono presentare un ciclo di vita ritardato, quindi l'immunodetezione può essere eseguita contemporaneamente insieme ai controlli.

7. Blocco dei tessuti

1. Incubare le ghiandole salivari in 1 mL di Buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Tritone X-100 + 1 mM EDTA) per 2 ore a temperatura ambiente con rotazione.

8. Immunostaining

1. Rimuovere tutto il buffer B e aggiungere tampone A (PBS + 0,1% BSA) più anticorpo di interesse.
   NOTA: Utilizziamo l'HP1a C1A9c (anticorpo concentrato) di Hybridoma Bank fino a 1:3000. Quando si utilizzano i C1A9 (supernatanti) abbiamo provato da 1:100 a una diluizione 1:500 e qualsiasi diluizione tra questo rango funziona bene) durante la notte a 4 oC con rotazione. A questo punto è importante che lo scuotimento non sollevi bolle che potrebbero danneggiare l'anticorpo.

9. Lavaggio immunostaining

1. Eseguire lavaggi di 3 x 15 minuti con tampone B sotto agitazione a temperatura ambiente utilizzando 1 mL ogni volta.
2. Trasferire le ghiandole nel tampone B insieme all'anticorpo secondario accoppiato a un fluorofore per 2 ore in rotazione a 4 oC (l'anticorpo secondario Alexa fluor 568 Invitrogen è stato utilizzato 1:3000).
   1. Coprire il tubo con un foglio di carta in alluminio per proteggere l'anticorpo secondario dalla luce.
3. Effettuare lavaggi di 2 x 15 minuti a temperatura ambiente durante la rotazione con 1 mL di Tampone B.
4. Incubare con un marcatore di DNA come Sytox (assumere 2 μL di 5 mM di stock e sciogliere in 1 mL di Tampone B) o Hoechst (assumere 1 μL di 10 mg/mL di stock e sciogliere in 1 mL di Buffer B) per 10 minuti a temperatura ambiente con rotazione.
5. Effettuare un lavaggio con buffer B e una volta con PBS, ogni lavaggio della durata di 10 minuti mentre ruota a temperatura ambiente.
   NOTA: Ricordati di proteggerlo dalla luce.

10. Imaging

1. Montare le ghiandole salivari su uno scivolo, facendo una piscina con un coverslip.
2. Mettere le ghiandole salivari al centro della piscina e coprire con AF1 citifluor per evitare la formazione di bolle che estendono il liquido viscoso in tutto il luogo. Quindi sigillare tutti i lati con smalto chiaro.
3. Osservare sotto una fluorescenza o un microscopio confocale. Se il campione non deve essere osservato lo stesso giorno, conservare lontano dalla luce a 4 °C.
4. Usa GraphPad Prism 6 per generare tutti i grafici e le analisi statistiche.
5. Analizzare i dati della distribuzione HP1a nelle ghiandole salivari utilizzando il test Kruskal-Wallis. La significatività statistica è stata fissata a (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

Risultati

I risultati rappresentativi dell'immunoso immunosocienza HP1a nelle ghiandole salivari della Drosophila sono riportati nella figura 1. Un risultato positivo è quello di osservare un punto focale (figura 1a) (aggregato eterocromatico o condensa). Un risultato negativo è nessun segnale o segnale disperso. A volte si può osservare un doppio segnale, cioè con un doppio punto (Figura 1c), ma di solito si verifica in quantità min...

Discussione

La funzione cellulare degli organismi eucarioti può definire la struttura 3D all'interno del nucleo, che è supportata da interazioni tra diverse proteine con cromatina e varie molecole tra cui l'RNA. Negli ultimi tre anni, i condensati biologici che hanno avuto rilevanza, compresa l'eterocromatina, hanno assunto un ruolo fondamentale nella determinazione della separazione di fase promuovendo la distinta organizzazione spaziale nucleare della cromatina attiva e repressiva ^16,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	11351904	marca non critica
16% formaldeide	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, grado di biologia molecolare Marca	Roche	10735078001	non critica
Completo inibitori della proteasi Ultra EDTA-free proteasi inibitori	Merck	5892953001
Vetrino coprioggetti	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marca non critico
DTT	Sigma	d9779	marca non critico
EDTA	Sigma	E5134	marca non critico
EGTA			non critico
Vetrino	Guarnizione oro	3011	marca non critico
H3BO3	Baker	0084-01	marca non critica
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Modulo del prodotto  Concentrato 0,1 mL
KCl	Baker	3040-01	marca non critico
Metanolo	Baker	9070-03	marca non critico
NaCl	Sigma	71376	marca non critico
Marca NaOH			non critico
TUBI			marca non critico
Rotatore	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Agitatore per provette
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 mL
Tris	Milipore	648311	marca non critica
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marca non critica&
beta;-mercaptoetanolo	Bio-Rad	1610710	25 mL, marca non critica