Colorazione immunofluorescente per la visualizzazione delle proteine associate all'eterocromatina nelle ghiandole salivari della Drosophila

Summary

Questo protocollo mira a visualizzare gli aggregati di eterocromatina nelle cellule di politene di Drosophila.

Abstract

La visualizzazione degli aggregati di eterocromatina mediante immunosocienza può essere impegnativa. Molti componenti mammiferi della cromatina sono conservati in Drosophila melanogaster. Pertanto, è un modello eccellente per studiare la formazione e la manutenzione dell'eterocromatina. Le cellule politenizzate, come quelle che si trovano nelle ghiandole salivari di larve di terzo instar D. melanogaster, forniscono uno strumento eccellente per osservare la cromatina amplificata quasi mille volte e hanno permesso ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella distribuzione dell'eterocromatina nel nucleo. Sebbene l'osservazione dei componenti dell'eterocromatina possa essere effettuata direttamente nei preparati cromosomici di politene, la localizzazione di alcune proteine può essere alterata dalla gravità del trattamento. Pertanto, la visualizzazione diretta dell'eterocromatina nelle cellule completa questo tipo di studio. In questo protocollo, descriviamo le tecniche di immunostaining utilizzate per questo tessuto, l'uso di anticorpi fluorescenti secondari e la microscopia confocale per osservare questi aggregati di eterocromatina con maggiore precisione e dettaglio.

Introduction

Fin dai primi studi di Emil Heitz^1,l'eterocromatina è stata considerata un importante regolatore dei processi cellulari come l'espressione genica, la separazione meiotica e mitotica dei cromosomi e il mantenimento della stabilità del^{genoma 2,3,4}.

L'eterocromatina è principalmente divisa in due tipi: l'eterocromatina costitutiva che definisce tipicamente sequenze ripetitive e gli elementi trasponibili presenti in specifici siti cromosomici come i telomeri e i centromeri. Questo tipo di eterocromatina è definito principalmente....

Protocol

1. Terza cultura delle larve instar

1. Preparare 1 litro di mezzi standard aggiungendo 100 g di lievito, 100 g di zucchero di canna intero non raffinato, 16 g di agar, 10 mL di acido propionico e 14 g di gelatina. Sciogliere tutti gli ingredienti tranne il lievito in 800 mL di acqua del rubinetto e quindi sciogliere il lievito. Autoclave immediatamente per 30 minuti.
   1. Successivamente, lasciare raffreddare il supporto a 60 °C e aggiungere acido propionico a una concentrazione finale dello 0,01%. Lasciare riposare la bottiglia fino a formare la gelatina.
2. Per ottimizzare la cultura delle larve 3o instar, raccogli prima adulti di età d....

Results

I risultati rappresentativi dell'immunoso immunosocienza HP1a nelle ghiandole salivari della Drosophila sono riportati nella figura 1. Un risultato positivo è quello di osservare un punto focale (figura 1a) (aggregato eterocromatico o condensa). Un risultato negativo è nessun segnale o segnale disperso. A volte si può osservare un doppio segnale, cioè con un doppio punto (Figura 1c), ma di solito si verifica in quantità min.......

Discussion

La funzione cellulare degli organismi eucarioti può definire la struttura 3D all'interno del nucleo, che è supportata da interazioni tra diverse proteine con cromatina e varie molecole tra cui l'RNA. Negli ultimi tre anni, i condensati biologici che hanno avuto rilevanza, compresa l'eterocromatina, hanno assunto un ruolo fondamentale nella determinazione della separazione di fase promuovendo la distinta organizzazione spaziale nucleare della cromatina attiva e repressiva ^16,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL	Axygen MCT-150-C	11351904	marca non critica
16% formaldeide	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, grado di biologia molecolare Marca	Roche	10735078001	non critica
Completo inibitori della proteasi Ultra EDTA-free proteasi inibitori	Merck	5892953001
Vetrino coprioggetti	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marca non critico
DTT	Sigma	d9779	marca non critico
EDTA	Sigma	E5134	marca non critico
EGTA			non critico
Vetrino	Guarnizione oro	3011	marca non critico
H3BO3	Baker	0084-01	marca non critica
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Modulo del prodotto  Concentrato 0,1 mL
KCl	Baker	3040-01	marca non critico
Metanolo	Baker	9070-03	marca non critico
NaCl	Sigma	71376	marca non critico
Marca NaOH			non critico
TUBI			marca non critico
Rotatore	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Agitatore per provette
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1,5 mL
Tris	Milipore	648311	marca non critica
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marca non critica&
beta;-mercaptoetanolo	Bio-Rad	1610710	25 mL, marca non critica