Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.
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Articolo metodologico
Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno
In questo articolo
Sommario
Abstract
La retinopatia indotta da ossigeno (OIR) è ampiamente utilizzata per studiare la crescita anormale dei vasi nelle malattie ischemiche della retina, tra cui la retinopatia della prematurità (ROP), la retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e l'occlusione venosa retinica (RVO). La maggior parte degli studi OIR osserva la neovascolarizzazione retinica in punti temporali specifici; tuttavia, la crescita dinamica dei vasi nei topi vivi lungo un corso temporale, che è essenziale per comprendere le malattie dei vasi correlate all'OIR, è stata poco studiata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per l'induzione del modello murino OIR, evidenziando le potenziali insidie e fornendo un metodo migliorato per quantificare rapidamente le aree di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. Ancora più importante, abbiamo monitorato la ricrescita dei vasi in topi vivi da P15 a P25 eseguendo l'angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA) nel modello murino OIR. L'applicazione di FFA al modello murino OIR ci consente di osservare il processo di rimodellamento durante la ricrescita dei vasi.
Introduzione
La neovascolarizzazione retinica (RNV), definita come uno stato in cui nuovi vasi patologici hanno origine da vene retiniche esistenti, di solito si estende lungo la superficie interna della retina e cresce nello spazio vitreo (o sottoretinico in alcune condizioni)1. È un segno distintivo e una caratteristica comune di molte retinopatie ischemiche, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), l'occlusione venosa retinica (RVO) e la retinopatia diabetica proliferativa (PDR)2.
Numerose osservazioni cliniche e sperimentali hanno indicato che l'ischemia è la causa principale della neovascolarizzazi....
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Protocollo
Tutte le procedure che prevedono l'uso di topi sono state approvate dal comitato etico sperimentale sugli animali del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat-sen University, Cina (numero autorizzato: 2020-082) e in conformità con le linee guida approvate del Comitato per la cura e l'uso degli animali del Centro oftalmico di Zhongshan e la dichiarazione dell'Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Induzione del modello OIR del topo
- Utilizzare topi con un tasso inferiore di malformazione congenita degli occhi, ad esempio topi C57BL / 6J, e accoppiarli con un r....
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Risultati
Nel modello murino OIR, il risultato più importante e basilare è la quantificazione dell'area VO e NV. Dopo aver vissuto nell'ambiente iperossia per 5 giorni da P7, la retina centrale dei cuccioli ha mostrato la più grande area di non perfusione. Sotto la stimolazione dell'ipossia in altri 5 giorni, è stata gradualmente prodotta la neovascolarizzazione retinica che ha fluorescenza più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Dopo P17, il segnale di fluorescenza della neovascolarizzazione patologica è regredito .......
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Discussione
La suscettibilità dei topi all'OIR è influenzata da molti fattori. I cuccioli di diverso background genetico e ceppi non possono essere confrontati. Nei topi albini BALB/c, i vasi ricrescono rapidamente nell'area VO con ciuffi neovascolari significativamente ridotti38, che portano alcune difficoltà alla ricerca. Nei topi C57BL/6, c'è un aumento del danno ai fotorecettori rispetto al ceppo murino BALB/cJ39,40. Lo stesso vale per diversi tip.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio e del laboratorio oftalmico per animali del Centro oftalmico di Zhongshan per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Prof. Chunqiao Liu per il supporto sperimentale. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Pechino, Cina), la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia del Guangdong, Cina (Grant No.2019A1515011347) e il progetto di costruzione di ospedali di alto livello dello State Key Laboratory of Ophthalmology presso il Centro oftalmico di Zhongshan (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincia del Guangdong, Cina).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa sterile da 1 mL | Solarbio | YA0550 | Per la preparazione di montature piatte retiniche e iniezione intraperitoneale |
| 1& Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Provetta per microcentrifuga da 2 ml | Corning | MCT-200-C | Per la preparazione di montature piatte retiniche Piastre |
| pozzetti multipli trattate con TC | Corning | 3548 | Per la preparazione di montature piatte retiniche Vetrini |
| per microscopio adesivi | Vari | Per la preparazione di montature piatte retiniche | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | Per l'analisi delle immagini | |
| Gas di anidride carbonica | Vari | Per sacrificio | |
| Vetrino di copertura | Vari | Per la preparazione di montature piatte retiniche | |
| Pinze curve | World Precision Instruments | 14127 | Per la preparazione di montature piatte retiniche Soluzione |
| colorante DAPI | Abcam | ab228549 | Per la marcatura del nucleo su montature piatte retiniche |
| Microscopio da dissezione | Olmpus | SZ61 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Fluoresceina sodica | Sigma-Aldrich | F6377 | Per in vivo imaging |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss | AxioImager.Z2 | Per l'acquisizione di immagini di fluorescenza di montature piatte retiniche |
| Fluoromount-G Mezzi di montaggio | SouthernBiotech | 0100-01 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Idrossipropilmetilcellulosa | Maya | 89161 | Per l'imaging in vivo |
| Anticorpo Isolectina B4 594 | Invitrogen | I21413 | Per la marcatura della vascolarizzazione retinica su montature piatte retiniche |
| Topi C57/BL6J | GemPharmatech della provincia | Per l'induzione del modello OIR | |
| Micro dissezione forbici-lama dritta | World Precision Instruments | 503242 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| No.4 pinze diritte | World Precision Instruments | 501978-6 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Siero d'asino normale | Abcam | ab7475 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Sensore O2 | Varie | Per il monitoraggio del livello di O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | Per l'induzione del modello OIR |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Per la fissazione dei tessuti |
| Pentobarbital sodico | Vari | Per anestesia | |
| Soda lime | Vari | Per assorbire l'eccesso di CO2 nella camera di ossigeno | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | Per imaging in vivo |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | Per analisi statistiche | |
| Agitatore di declorazione Tansference | Kylin-Bell | ZD-2008 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Piatto di coltura tissutale (attacco basso) | Corning | 3261-20EA | Per la preparazione di montature piatte retiniche Pipette |
| trasferimento | Varie | Per la preparazione di montature piatte retiniche | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | Per la preparazione di montature piatte retiniche |
| Tropicamide | Vari | Per l'imaging in vivo | |
| ZEN Software di imaging | ZEISS | Per l'acquisizione e l'esportazione |
Riferimenti
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....
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Ristampe e permessi
