Questo articolo descrive l'isolamento delle cellule della valvola aortica del topo con una procedura in due fase di collagenasi. Le cellule isolate della valvola del topo sono importanti per eseguire diversi saggi, come questo saggio di calcificazione in vitro, e per studiare le vie molecolari che portano alla mineralizzazione della valvola aortica.
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Articolo metodologico
Isolamento delle celle della valvola interstiziale del topo per studiare la calcificazione della valvola aortica in vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
La calcificazione delle cellule della valvola aortica è il segno distintivo della stenosi aortica ed è associata alla fibrosi della cuspide valvolare. Le cellule interstiziali valvolari (CCI) svolgono un ruolo importante nel processo di calcificazione nella stenosi aortica attraverso l'attivazione del loro programma di dedifferenziazione alle cellule simili agli osteoblasti. I VIC del topo sono un buon strumento in vitro per la spiegazione delle vie di segnalazione che guidano la mineralizzazione della cella della valvola aortica. Il metodo descritto nel presente documento, utilizzato con successo da questi autori, spiega come ottenere cellule appena isolate. È stata eseguita una procedura in due fase di collagenasi con 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. Il primo passo è fondamentale per rimuovere lo strato cellulare endoteliale ed evitare qualsiasi contaminazione. La seconda incubazione di collagenasi è facilitare la migrazione dei CCI dal tessuto alla piastra. Inoltre, viene discussa una procedura di colorazione dell'immunofluorescenza per la caratterizzazione del fenotipo delle cellule isolate della valvola del topo. Inoltre, il saggio di calcificazione è stato eseguito in vitro utilizzando la procedura di misurazione del reagente del calcio e la colorazione rossa di alizarina. L'uso della coltura primaria delle celle della valvola del topo è essenziale per testare nuovi obiettivi farmacologici per inibire la mineralizzazione cellulare in vitro.
Introduzione
La malattia della valvola aortica calcificata (CAVD) è la malattia cardiaca valvulare più diffusa nelle popolazioni occidentali, che colpisce quasi il 2,5% degli individui anziani di età superiore ai 65anni 1. CAVD colpisce oltre sei milioni di americani ed è associato a cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei volantini che compromettono il normale flusso sanguigno1,2. Attualmente, non esiste un trattamento farmacologico per fermare la progressione della malattia o attivare la regressione minerale. L'unica terapia efficace per trattare cavd è la sostituzione della valvola aortica con....
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Protocollo
NOTA: Tutte le procedure animali qui descritte sono state approvate dalla Icahn School of Medicine presso il nucleo istituzionale del Monte Sinai e il comitato per l'uso.
1. Preparazione prima dell'isolamento delle cellule valvolare dai topi adulti
- Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mostrati nella figura 1A utilizzando il 70% v/v di etanolo e successivamente autoclavandoli per 30 minuti pulire lo spazio di lavoro chirurgico con il 70% di etanolo.
- Aggiungere 500 μL di penicillina-streptomicina a 50 mL di HEPES da 10 mm. Preparare un'aliquota di 50 mL di 1x soluzione salina t....
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Risultati
Poiché le valvole aortiche murine hanno in genere un diametro di 1 mm, almeno tre valvole devono essere raggruppate per raccogliere un milione di celle vitali per diverse procedure sperimentali. I diversi passaggi del processo di isolamento VIC sono riportati nella figura 1 e nella figura 2. Poiché è difficile raschiare manualmente il tessuto della valvola, è preferibile utilizzare la sollecitazione di taglio creata dal vortice per rimuovere i CCI. In effetti, i.......
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Discussione
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di isolamento delle celle della valvola del mouse per le impostazioni cultura primarie. Tre valvole aortiche di topi di 8 settimane sono state raggruppate per ottenere un numero adeguato di cellule. Inoltre, questo protocollo descrive la caratterizzazione del fenotipo VIC e il saggio di mineralizzazione in vitro . Il metodo è stato adattato dal protocollo precedentemente descritto da Mathieu etal.
Dura.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Forbici taglienti da 3 mm | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alfa muscolo liscio Anticorpo | actina abcam | ||
| Anti-topo, Alexa Fluor 488 coniugato | Cell Signaling | 4412 | |
| Set di reagenti Arsenazo-III | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit per misurare la concentrazione di calcio |
| Forbici Bonn | F.S.T | 14184-09 | |
| Idrossido di calcio | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenasi tipo I (125 unità/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Pinza graefe extra fine | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Pinza fine | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M soluzione | CELLULE STAMINALI TECNOLOGIE | ||
| L-Glutammina 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Reagente per l'eliminazione del micoplasma |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillina streptomicina 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Piruvato di sodio 100 mM | Thermofisher Scientific | ||
| Pinze modello standard | Forbici chirurgiche F.S.T | 11000-12 | |
| - Affilato-Smussato | F.S.T | 14008-14 | |
| Tripsina 0,05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
Riferimenti
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....
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Ristampe e permessi
