Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.
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Articolo metodologico
Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) è uno dei più comuni patogeni opportunistici associati alla fibrosi cistica (FC). Una volta stabilita la colonizzazione della Pa, gran parte dei batteri infettivi forma biofilm all'interno dell'espettorato delle vie aeree. I biofilm di Pa isolati dall'espettorato CF hanno dimostrato di crescere in piccoli aggregati densi di ~ 10-1.000 cellule che sono organizzate spazialmente e mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come la tolleranza antimicrobica. Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell'espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Utilizzando un mezzo sintetico per l'espettorato CF (SCFM2), la storia di vita degli aggregati di Pa può essere osservata utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e l'analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Questo sistema in vitro permette l'osservazione di migliaia di aggregati di varie dimensioni in tempo reale, tridimensionali, e su scala micron. A livello individuale e di popolazione, avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione facilita l'osservazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo e la loro risposta ai cambiamenti nel microambiente, come il trattamento antibiotico, da differenziare con precisione.
Introduzione
Pseudomonas aeruginosa (Pa) è un patogeno opportunistico che stabilisce infezioni croniche in individui immuno-compromessi. Per quelli con la malattia genetica fibrosi cistica (FC), queste infezioni possono durare nel corso della vita. La FC provoca l'accumulo di un espettorato viscoso e ricco di sostanze nutritive nelle vie aeree, che viene colonizzato da una varietà di agenti patogeni microbici nel tempo. Pa è uno dei patogeni CF più diffusi, colonizzando le vie aeree nella prima infanzia e stabilendo infezioni difficili da trattare1. La Pa rimane un problema clinico significativo ed è considerata una delle principa....
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Protocollo
1. Preparare il mezzo sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2)
NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 2). Per i dettagli completi e i riferimenti, vedere9,10,12.
Figura 2: Preparazione e inoculazione del mezzo SCFM2. (A) La base ....
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Risultati
Questo lavoro descrive i metodi per osservare gli aggregati di Pa ad alta risoluzione e in un ambiente simile a quello dell'infezione cronica del polmone CF9,10,12. SCFM2 fornisce un sistema in vitro che promuove l'aggregazione naturale delle cellule Pa in dimensioni simili a quelle osservate durante l'infezione effettiva10. L'adattabilità di SCFM2 come mezzo definito può essere.......
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Discussione
Questo lavoro ha introdotto metodologie che possono essere combinate per studiare le popolazioni di aggregati batterici in presenza e assenza di trattamento antibiotico. ClSM ad alta risoluzione consente la visualizzazione dei cambiamenti nella biomassa aggregata e l'orientamento strutturale degli aggregati in tempo reale quando esposti agli antibiotici. Inoltre, le caratteristiche fisiche e strutturali della biomassa che rimangono dopo il trattamento con antibiotici possono essere quantificate, con l'obiettivo di correl.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
S.E.D è supportato da fondi di start-up forniti dal Dipartimento di Medicina Molecolare, The University of South Florida, nonché da una borsa di ricerca CFF (DARCH19G0), dal N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, Chen)) e dall'USF Institute on Microbiomes. Ringraziamo il laboratorio whiteley per la collaborazione in corso che coinvolge set di dati relativi a questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Charles Szekeres per aver facilitato lo smistamento FACS. Le figure sono state create da A.D.G e S.E.D utilizzando Biorender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aminoacidi | |||
| Alanina | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginina HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagina | Acros Organics | 56-84-8 | Preparato in 0,5 M NaOH |
| Cistina HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Acido glutammico HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Istidina HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucina | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucina | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lisina HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Metionina | Acros Organics | 63-68-3 | |
| Ornitina HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Fenilalanina | Acros Organics | 63-91-2 | |
| Prolina | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serina | Alfa Aesar | A11179 | |
| Treonina | Acros Organics | 72-19-5 | |
| Triptofano | Acros Organics | 73-22-3 | Preparato in 0,2 m NaOH |
| Tirosina | Alfa Aesar | A11141 | Preparato in 1,0 M NaOH |
| Valina | Acros Organics | 72-18-4 | |
| Antibiotico | |||
| Carbenicillina | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Giorno di scorte | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Destrosio (D-glucosio) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | agitare 15-20 min a 37 ° C per evaporare il cloroformio |
| FeSO4 * 7H2O | Acros Organics | 7782-63-0 | questo stock equivale a 1 mg/mL, DEVE fare acido |
| L-lattico | Alfa Aesar | L13242 | pH stock a 7 con NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetilglucosamina | TCI | A0092 | |
| Solidi | |||
| Mucina suina | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Sperma di salmone DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Colorazione | |||
| Ioduro di propidio | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Sali K | |||
| 2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | aggiungere solido direttamente alla base tamponata |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | aggiungere solido direttamente alla base tamponata |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | aggiungere solido direttamente alla base tamponata |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | aggiunge solido direttamente alla base tamponata |
| Materiali di | |||
| consumoProvette coniche (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Provette coniche (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Provette per colture con tappo per flusso d'aria | Olympus plastics | 21-129 | |
| Piatto a quattro camere da 35 mm con fondo in vetro | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) brodo | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Punte per pipette (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Punte per pipette (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Pipette sierologiche (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Pipette sierologiche (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Pipette sierologiche (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Acqua ultrapura (senza RNasi/DNasi); acqua nanopura | Genessee Scientific | 18-194 | Acqua nanopura utilizzata per la preparazione di soluzioni in Tabella 1 |
| Siringhe (10 mL) | BD | 794412 | |
| Siringhe (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0,22 mm Filtro per siringhe in PES | Olympus | 25-244 | |
| PS cuvetta semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | Per preparare le figure | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | versione 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Attrezzatura | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 microscopio a scansione laser confocale | Zeiss |
Riferimenti
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data....
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Ristampe e permessi
