Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Ji Won Park; Samantha M. Thomas; Lee J. Wylie; Andrew M. Jones; Anni Vanhatalo; Alan N. Schechter; Barbora Piknova

doi:10.3791/62427

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Articolo metodologico

Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

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DOI:

10.3791/62427

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29 luglio 2021

Ji Won Park^*¹ , Samantha M. Thomas^*¹ , Lee J. Wylie² , Andrew M. Jones² , Anni Vanhatalo² , Alan N. Schechter¹ , Barbora Piknova¹

¹Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, ²Sport and Health Sciences, College of Life and Environmental Sciences, St Luke’s Campus, University of Exeter

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l'omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell'omogeneizzazione.

Abstract

Una volta si pensava che gli ioni nitrato (NO₃^-) fossero prodotti finali inerti del metabolismo dell'ossido nitrico (NO). Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che gli ioni nitrato possono essere riconvertiti in NO nei mammiferi attraverso un meccanismo di riduzione in due fasi: il nitrato viene ridotto a nitrito (NO₂^-) principalmente dai batteri commensali orali, quindi il nitrito viene ridotto a NO da diversi meccanismi, tra cui proteine contenenti eme o molibdeno. Questa via riduttiva dei nitrati contribuisce a migliorare le vie di segnalazione NO-mediate, in particolare nel sistema cardiovascolare e durante l'esercizio muscolare. I livelli di nitrato nell'organismo prima di tale utilizzo sono determinati da due diverse fonti: l'ossidazione endogena di NO e l'assunzione di nitrati nella dieta, principalmente dalle piante. Per chiarire il complesso ciclo dell'NO in circostanze fisiologiche, abbiamo esaminato ulteriormente la dinamica dei suoi metaboliti, nitrati e ioni nitriti, che sono relativamente stabili rispetto a NO. In studi precedenti il muscolo scheletrico è stato identificato come un importante organo di stoccaggio per gli ioni nitrato nei mammiferi, nonché una fonte diretta di NO durante l'esercizio. Pertanto, stabilire una metodologia affidabile per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel muscolo scheletrico è importante e dovrebbe essere utile per estenderne l'applicazione ad altri campioni di tessuto. Questo articolo spiega in dettaglio la preparazione di campioni di muscolo scheletrico, utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione, per misure di nitrati e nitriti e discute importanti questioni relative ai processi di omogeneizzazione, compresa la dimensione dei campioni. Le concentrazioni di nitrati e nitriti sono state confrontate anche in quattro diversi gruppi muscolari.

Introduzione

L'ossido nitrico (NO), una piccola molecola di segnalazione gassosa, svolge un ruolo critico nei processi fisiologici e fisiopatologici¹. L'NO può essere prodotto dalla L-arginina da enzimi endogeni della famiglia delle ossidi nitrici sintasi (NOS) prima di subire una rapida ossidazione a nitrato (NO 3-) e, possibilmente, nitrito (NO 2^-) nel sangue e nei tessuti ^2,3. Recentemente, questi anioni hanno dimostrato di essere ridotti a NO nei sistemi di mammiferi⁴. Il nitrato viene convertito in nitrito, principalmente dalle....