Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Summary

Descriviamo il metodo per l'analisi quantitativa della distribuzione di Aspergillus fumigatus conidia (3 μm di dimensione) nelle vie aeree dei topi. Il metodo può anche essere utilizzato per l'analisi della distribuzione di microparticelle e agglomerato di nanoparticelle nelle vie aeree in vari modelli di condizioni patologiche.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia sono agenti patogeni presenti nell'aria che possono penetrare nelle vie aeree umane. Le persone immunocompetenti senza allergie mostrano resistenza e tolleranza immunologica, mentre nei pazienti immunocompromessi, i conidi possono colonizzare le vie aeree e causare gravi disturbi respiratori invasivi. Varie cellule in diversi compartimenti delle vie aeree sono coinvolte nella risposta immunitaria che previene l'invasione fungina; tuttavia, gli aspetti spazio-temporali dell'eliminazione dei patogeni non sono ancora completamente compresi. L'imaging tridimensionale (3D) di organi a montaggio intero otticamente cancellati, in particolare i polmoni di topi sperimentali, consente il rilevamento di agenti patogeni etichettati fluorescentmente nelle vie aeree in diversi punti temporali dopo l'infezione. Nel presente studio, descriviamo una configurazione sperimentale per eseguire un'analisi quantitativa della distribuzione di A. fumigatus conidia nelle vie aeree. Utilizzando la microscopia a scansione laser confocale fluorescente (CLSM), abbiamo tracciato la posizione dei conidi etichettati fluorescentemente nei rami bronchiali e nel compartimento alveolare 6 ore dopo l'applicazione orofaringea ai topi. L'approccio qui descritto è stato precedentemente utilizzato per il rilevamento della posizione precisa del patogeno e l'identificazione delle cellule che interagiscono con i patogeni in diverse fasi della risposta immunitaria. La configurazione sperimentale può essere utilizzata per stimare la cinetica dell'eliminazione del patogeno in diverse condizioni patologiche.

Introduction

Su base giornaliera, le persone inalano agenti patogeni presenti nell'aria, comprese le spore di funghi opportunistici Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) che possono penetrare nel tratto respiratorio¹. Il tratto respiratorio dei mammiferi è un sistema di vie aeree di diverse generazioni che sono caratterizzate dalle diverse strutture delle pareti delle vie aeree^2,3,4. Le pareti tracheobronchiali sono costituite da diversi tipi di cellule tra cui cellule ciliate che forniscono la clearance mucociliare⁵....

Protocol

Tutti i metodi riguardanti gli animali da laboratorio qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Istituto di chimica bioorganica Shemyakin e Ovchinnikov, Accademia russa delle scienze (numero di protocollo 226/2017).

1. Applicazione di A. fumigatus conidia

1. Per ottenere conidia etichettata fluorescentemente A. fumigatus, fissare 5 ×^{10 8} conidi aggiungendo 1 mL di paraformaldeide al 3% al pellet di conidi. Incubare in una provetta da 50 ml per 2 ore su uno shaker a temperatura ambiente.
2. Lavare i conidi con 20 mL di soluzione ....

Results

Seguendo il protocollo di cui sopra, è stata ottenuta l'immagine 3D che mostra le vie aeree e A. fumigatus conidia nel lobo polmonare di un topo (Figura 1A). Streptavicina (che è stata utilizzata per la visualizzazione delle vie aeree) etichettato bronchi e bronchioli¹⁵. Inoltre, i grandi vasi, che sono facilmente distinguibili dalle vie aeree per la loro morfologia, e la pleura sono visualizzati nel canale delle vie aeree (Figura 1A

Discussion

L'imaging 3D dell'intero organo consente di ottenere i dati senza dissezione del campione, che è di grande importanza per indagare gli aspetti spaziali della distribuzione anatomica del patogeno nell'organismo. Esistono diverse tecniche e modifiche della compensazione ottica tissutale che aiutano a superare la diffusione della luce laser e consentono l'imaging di organi interi^15,16,18,19. Uno d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidi	ATCC	46645	Il ceppo AfS150, un derivato ATCC 46645
Alcool benzilico	Panreac	141081.1611	98,0-100 %
Benzil benzoato	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 topi	Pushchino Animal Centro di riproduzione (Russia)		Maschio. 12 - 30 settimane.
Catetere	Venisystems	G715-A01	18G
Copertura per imaging cellulare camera con fondo in vetro	Eppendorf	30742028	Camera a 4 o 8 pozzetti con fondo in vetro di copertura
Centrifuga	Eppendorf	5804R	Qualsiasi centrifuga fornita 1000 g può essere utilizzata
Microscopio a scansione laser confocale	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich	276855	≥ 99,9%
Pacchetto di elaborazione delle immagini FIJI	Software gratuito	FIJI
Pinza	B. Braun Aesculap	BD557R	Pinza dentata
	B. Braun Aesculap	BD321R	Pinza a punta fine
	Bochem	1727
Bottiglia di vetro	DURAN	242101304	Con coperchio a terra
Editor grafico Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		La prova gratuita è disponibile https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Obiettivo	ZEISS	420640-9800-000	Piano-Apocromatico, 10 & volte; (NA = 0,3)
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipetta	ProLine	722020	da 5 a 50 μ L
Latte in polvere	Roth	T145.2
Miscelatore per campioni	Dynal	MXIC1
Forbici	B. Braun	BC257R	Agitatore smussato
	Apexlab	GS-20	50-300 giri/min
Skalpel	Bochem	12646
Filo di seta	B. Braun		3 USP
Streptavidina, Alexa Fluor 488 coniugato	ThermoFisher	S11223
Provetta	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (idrossimetilamminometano)	Helicon	H-1702-0.5	il signor 121,14; Numero CAS: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN software	microscopio ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html