Articolo metodologico

Peptidi di screening che attivano MRGPRX2 utilizzando cellule HEK ingegnerizzate

DOI:

10.3791/62448

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6 novembre 2021

 ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, Donadeo Innovation Centre for Engineering, University of Alberta, 2School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

In questo articolo

Sommario

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Vengono descritte le tecniche per generare una libreria di peptidi corti in grado di attivare i mastociti tramite il recettore MRGPRX2. Le tecniche associate sono facili, poco costose e possono essere estese ad altri recettori cellulari.

Abstract

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Identificare i ligandi specifici per i recettori cellulari terapeuticamente significativi è fondamentale per molte applicazioni, tra cui la progettazione e lo sviluppo di nuove terapie. Il recettore della proteina G correlato a Mas X2 (MRGPRX2) è un importante recettore che regola l'attivazione dei mastociti e, quindi, dirige la risposta immunitaria generale. Sono stati identificati numerosi ligandi per MRGPRX2 e includono peptidi endogeni come PAMP, defensine, LL-37 e altri frammenti proteici (cioè albumina degradata). Un'ulteriore identificazione di ligandi specifici di MRGPRX2 richiede lo screening di un gran numero di peptidi (cioè la libreria peptidica); tuttavia, i mastociti sono difficili e costosi da mantenere in vitro e, quindi, non economici da utilizzare per lo screening di un gran numero di molecole. Il presente documento dimostra un metodo per progettare, sviluppare e vacalare una libreria di piccole molecole peptidiche utilizzando MRGPRX2 che esprimono cellule HEK. Questa linea cellulare è relativamente facile e poco costosa da mantenere e può essere utilizzata per l'analisi in vitro ad alto rendimento. Un colorante fluorescente Fura-2 sensibile al calcio per marcare il flusso di calcio intracellulare all'attivazione è stato utilizzato per monitorare l'attivazione. Il rapporto tra l'intensità di fluorescenza di Fura-2 a 510 nm contro lunghezze d'onda di eccitazione di 340 e 380 nm è stato utilizzato per calcolare la concentrazione di calcio. La libreria peptidica utilizzata per verificare questo sistema era basata sul secretagogo endogeno proadrenomedullina N-terminale 12 (PAMP-12), che è noto per legare MRGPRX2 con elevata specificità e affinità. I peptidi successivi sono stati generati attraverso il troncamento degli aminoacidi e le tecniche di scansione dell'alanina applicate a PAMP-12. Il metodo qui descritto è semplice e poco costoso ma robusto per lo screening di una vasta libreria di composti per identificare domini di legame e altri parametri importanti che svolgono un ruolo importante nell'attivazione del recettore.

Introduzione

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I mastociti sono parte integrante del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie sia innate che adattative. I mastociti sono attivati principalmente dal legame di un antigene al complesso immunoglobulina E (IgE) - recettore FcεRI, o dal recettore della proteina G correlato a mas recentemente scoperto-X2 (MRGPRX2)1. L'attivazione di MRGPRX2 è stata collegata a diverse malattie immunitarie e infiammatorie e, quindi, è importante comprendere il meccanismo di legame del recettore ai suoi ligandi2. Per fare ciò, è stata sviluppata una libreria di piccole molecole peptidiche e sottoposte a scre....

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Protocollo

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1. Progettazione e sviluppo di librerie peptidiche

  1. Per identificare i ligandi del recettore MRGPRX2 dei mastociti sulla base di un ligando noto, ad esempio PAMP-1213, seguire i passaggi seguenti.
    1. Generare una libreria peptidica N-troncata troncando i residui di amminoacidi N-terminali del ligando, in successione, mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS).
    2. Generare una libreria peptidica C-troncata troncando i residui di amminoacidi C-terminali del ligando noto, in successione, mediante SPPS.
    3. Sulla base dei risultati di 1.1.1 e 1.1.2, generare una libreria peptidica troncata N + C u....

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Risultati

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La Tabella 1 contiene le sequenze peptidiche generate attraverso il troncamento degli amminoacidi terminali e la scansione dell'alanina. Come mostrato nella Tabella 1,la sequenza peptidica RKKWNKWALSR manca di fenilalanina N-terminale (F) rispetto al suo genitore PAMP-12 e quindi è un peptide rappresentativo nella libreria N-troncata. Allo stesso modo, in FRKKWNKWALS, la serina C-terminale PAMP-12 è stata rimossa, rappresentando una libreria peptidica C-troncata derivata da PAMP-12. Nell.......

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Discussione

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La segnalazione del calcio è fondamentale per la degranulazione dei mastociti ed è stata ampiamente utilizzata nello studio delle interazioni recettore-ligando, dell'identificazione del ligando e della scoperta di farmaci14. MRGPRX2 è un recettore dei mastociti scoperto di recente che è stato trovato per svolgere un ruolo chiave in molte malattie infiammatorie come prurito, asma e dermatite atopica, tra gli altri2. Inoltre, diversi farmaci approvati hanno dimostrato di susc.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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SR e LDU vorrebbero riconoscere Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC e NSERC-Discovery grant per questo progetto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina sierica bovinaSigma Aldrich5470
Cloruro di calcioSigma Aldrich793939
Corning 96 pozzettiSigma AldrichCLS3603
Micropiastra in polistirene neroSigma AldrichCLS3603
DMEMThermo Fischer11995065DMSO ad alto contenuto di glucosio
DMSO Thermo FischerD12345Sterile, grado biologico
EGTASigma AldrichE3889
Siero fetale bovinoThermo Fischer12483-020
Flexstation 3Dispositivi molecolariFV06060
Fura-2 AMThermo FischerF1221
GlucosioSigma AldrichD8270
HEPES tamponeThermo Fischer15630-080
IonomicinaSigma AldrichI9657
L GlutamminaThermo Fischer25030-081
Penna Strep ThermoFischer15140122
PeptidiRS SyntehsisCustom≥ puro al 95%;
N terminale - gruppo acetilico
C terminale - gruppo ammidico
Cloruro di potassioSigma Aldrich12636
Cloruro di sodioSigma AldrichS9888
TritonX-100DOWChemical 166704

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
  2. Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H.

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MRGPRX2 ActivationPeptide Library ScreeningEngineered HEK CellsMast Cell ActivationAlanine ScanningCalcium Flux AssayFura 2 DyeSolid Phase Peptide SynthesisFluorescence Plate ReaderAmino Acid Truncation

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