Peptidi di screening che attivano MRGPRX2 utilizzando cellule HEK ingegnerizzate

I mastociti sono parte integrante del sistema immunitario e svolgono un ruolo cruciale nelle risposte immunitarie sia innate che adattative. I mastociti sono attivati principalmente dal legame di un antigene al complesso immunoglobulina E (IgE) - recettore FcεRI, o dal recettore della proteina G correlato a mas recentemente scoperto-X2 (MRGPRX2)¹. L'attivazione di MRGPRX2 è stata collegata a diverse malattie immunitarie e infiammatorie e, quindi, è importante comprendere il meccanismo di legame del recettore ai suoi ligandi². Per fare ciò, è stata sviluppata una libreria di piccole molecole peptidiche e sottoposte a screening contro i recettori MRGPRX2 che sono stati sovraespressi nelle cellule HEK. Nello studio, la libreria peptidica è stata costruita utilizzando le tecniche semplici e versatili della scansione dell'alanina e del troncamento degli amminoacidi. La scansione dell'alanina comporta la sostituzione di aminoacidi specifici con un residuo di alanina. Essendo l'alanina piccola e neutra, spoglia il peptide delle proprietà specifiche conferite dal residuo sostituito ed evidenzia consecutivamente il significato delle rispettive proprietà fisiochimiche dell'amminoacido nelle interazioni recettoriali. Al contrario, nel troncamento degli amminoacidi, le sequenze peptidiche sono progettate in modo tale da mancare uno o più residui di amminoacidi dal terminale N, dal terminale C o da entrambi. Questo insieme di peptidi è stato utilizzato per identificare le sequenze di aminoacidi cruciali per il legame con MRGPRX2.

L'esperienza con le linee di mastociti umani (LAD-2) ha dimostrato che queste cellule sono difficili da coltura e mantenere in vitro:un tempo di raddoppio di due settimane, costosi integratori medi e attenzione diretta richiesta durante il passaggio³. Questi attributi rendono le cellule inadatte per lo screening su larga scala di potenziali ligandi. Qui, le cellule HEK stabilmente trasfettate che esprimono il recettore MRGPRX2 (HEK-X2) sono state utilizzate per lo screening della libreria peptidica¹. Le cellule HEK-293 sono ampiamente utilizzate e studiate per l'espressione eterologa dei recettori di superficie grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione, al tasso di raddoppio più veloce e alla necessità di integratori medi non costosi da colturare in laboratorio⁴. Il protocollo per trasfezionare la linea cellulare HEK-293 è stato dimostrato ed è ben consolidato⁵. Le cellule HEK-293 che esprimono stabilmente il recettore MRGPRX2 (passaggio 13-19) sono state attivate con i peptidi generati attraverso N-troncamento, C-troncamento, N + C-troncamento e scansione alanina¹. Le celle HEK di tipo selvaggio (HEK-WT) (passaggio 16-21) sono state utilizzate come controllo. Il rilascio intracellulare di calcio al momento dell'attivazione è stato monitorato per studiare l'attivazione basata su MRGPRX2.

L'attivazione cellulare da parte di MRGPRX2 è seguita da una mobilizzazione citosolica del calcio. Questo rilascio intracellulare regolato di calcio nei mastociti è regolato dall'ingresso di calcio gestito dal deposito (SOCE), coordinato dalla molecola di interazione stromale 1 (STIM1); ed è centrale per la cascata di risposta immunitaria^6,7. Sono stati utilizzati vari metodi per rilevare la concentrazione intracellulare di calcio, tra cui patch-clamp e coloranti fluorescenti⁸. Di tutte le tecniche disponibili, i coloranti fluorometrici di calcio in coniugazione con varie tecniche di rilevamento vengono ampiamente utilizzati⁹. Due tipi di coloranti fluorometrici che hanno guadagnato interesse sono vale a dire, coloranti a singola lunghezza d'onda come Fluo-4 e coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d'onda come Indo -1 e Fura-2. Il vantaggio che i coloranti ratiometrici a doppia lunghezza d'onda portano rispetto ai coloranti a singola lunghezza d'onda è che i coloranti ratiometrici correggono errori sperimentali come il caricamento del colorante, lo sbiancamento fotografico e la messa a fuoco^10,11.

L'estere acetossimetilico fura-2 (Fura-2 AM) è un colorante permeante cellulare, verde-fluorescente la cui eccitazione si sposta su una lunghezza d'onda inferiore dopo il legame con il calcio. Sperimentalmente, Fura-2 è eccitato a 340 e 380 nm, mentre l'emissione è registrata a 510 nm. Al momento del legame con il calcio, l'intensità fluorescente a 340 nm aumenta mentre quella di 380 nm diminuisce, come mostrato nella Figura 1. I dati sono rappresentati come un rapporto tra l'intensità di fluorescenza dopo l'eccitazione a 340 nm (F340) e quella dell'intensità dopo l'eccitazione a 380 nm (F380), cioè F340 / F380. Il rapporto F340/F380 è proporzionale al calcio intracellulare, il cui valore può essere calcolato dall'equazione di Grynkiewicz¹². Poiché il segnale di fluorescenza è ottenuto dall'eccitazione del colorante a due lunghezze d'onda (340 nm e 380 nm), il rapporto dei segnali di fluorescenza corregge fattori sperimentali come il carico del colorante, la perdita di colorante, il fotosciviazione e le densità cellulari.

1. Progettazione e sviluppo di librerie peptidiche

1. Per identificare i ligandi del recettore MRGPRX2 dei mastociti sulla base di un ligando noto, ad esempio PAMP-12¹³, seguire i passaggi seguenti.
   1. Generare una libreria peptidica N-troncata troncando i residui di amminoacidi N-terminali del ligando, in successione, mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS).
   2. Generare una libreria peptidica C-troncata troncando i residui di amminoacidi C-terminali del ligando noto, in successione, mediante SPPS.
   3. Sulla base dei risultati di 1.1.1 e 1.1.2, generare una libreria peptidica troncata N + C utilizzando SPPS troncando i residui desiderati dal terminale N e C, rispettivamente.
   4. Utilizzare la sintesi peptidica in fase solida per sintetizzare i peptidi¹³.
   5. Modificare il N-terminale in gruppo acetilico (Ac) e C-terminale in gruppo ammide.
   6. Caratterizzare il peptide per la sua purezza utilizzando la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e per la massa utilizzando uno spettrofotometro di massa.
2. Per studiare il significato di aminoacidi specifici all'interno della molecola madre PAMP-12, seguire i passaggi seguenti.
   1. Generare una libreria peptidica a scansione di alanina sostituendo i rispettivi residui di amminoacidi nella molecola peptidica con alanina, uno alla volta utilizzando SPPS. Modificare il N-terminale in gruppo acetilico (Ac) e C-terminale in gruppo ammide.
   2. Caratterizzare il peptide per la sua purezza utilizzando la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e per la massa utilizzando uno spettrofotometro di massa.
      NOTA: Assicurarsi che i peptidi sintetizzati siano di elevata purezza. Caratterizzare i peptidi utilizzando la spettroscopia di massa e l'HPLC.

2. Coltura cellulare in vitro

1. Colturare le celle HEK-X2 e HEK-WT seguendo i passaggi seguenti.
   1. Preparare il terreno di coltura integrando DMEM ad alto contenuto di glucosio con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-Glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
   2. Passare le cellule in palloni di coltura tissutale (TC) trattati con T-75 e crescere in un incubatore a 37 °C contenente il 5% di CO_2,fino a quando non sono confluenti al 75-80%.
   3. Una volta confluente al 75%, lavare le cellule e aggiungere 2-3 ml di tripsina per 2 - 3 min. Incubare in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per staccare le cellule.
   4. Una volta che le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule in tripsina. Aggiungere 6-9 ml di mezzo fresco.
   5. Centrifugare le celle a 1620 x g per 3-5 min.
   6. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante per raccogliere il pellet. Risuspendare le cellule in un terreno di coltura fresco. Diluire le cellule secondo la concentrazione desiderata.
      NOTA: le cellule HEK sono cellule a crescita rapida e quindi ottimizzano gli integratori del mezzo cellulare. Le cellule HEK sono cellule aderenti; farli passare in palloni di coltura trattati con TC per supportare l'adesione.
2. Preparare una piastra di dosaggio da 96 pozzetti per l'esperimento.
   1. Aggiungere 200 μL di sospensione cellulare in ogni pozzetaggio, con una concentrazione di 200.000 cellule/ml, per seminare 40.000 cellule/pozzede.
   2. Far crescere le cellule per 24 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO_2.
      NOTA: ottimizzare la densità della cella per pozzo in base alle dimensioni della piastra e al tipo di deformazione della cella. Condurre l'esperimento in triplicati in una piastra nera a 96 pozzetti trattata tc con fondo piatto trasparente.

3. Saggio del calcio Fura-2 AM

1. Preparare il colorante seguendo i passaggi seguenti.
   1. Usa il colorante Fura-2 AM per l'esperimento.
   2. Preparare il tampone HEPES-Tyrode (HTB) contenente 25 mM di hepes buffer, 120 mM di NaCl, 5 mM di KCl, 1 mg/mL di glucosio, 1 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 1,8 mM di CaCl₂ appena aggiunti in acqua sterilizzata in autoclave.
   3. Aggiungere 50 μL di DMSO in un flaconcino di Fura-2 AM da 50 μg per preparare 1 mM di soluzione stock di colorante Fura-2 AM. Aggiungere 1 μL di colorante Fura-2 AM da 1 mM per mL di mezzo fresco per preparare il mezzo di carico del colorante con concentrazione di colorante di 1 μM.
   4. Rimuovere la piastra del pozzo 96 dall'incubatore e scartare il mezzo. Sostituire il mezzo con un mezzo di caricamento del colorante fresco. Aggiungere 200 μL di mezzo di carico del colorante in ogni pozzo. Incubare le cellule per 30-40 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO_2.
   5. Dopo 40 minuti di incubazione, rimuovere il mezzo. Lavare le celle con il tampone HTB. Aggiungere 100 μL di tampone HTB per la lettura della fluorescenza. Prendi la piastra per la lettura della fluorescenza.
      NOTA: Ottimizzare la concentrazione di colorante nel mezzo di carico del colorante. La perdita di colorante e il fotosciviazione sono possibili preoccupazioni associate al colorante. Aggiungere CaCl₂ fresco nel buffer HTB per evitare precipitazioni.

4. Attivazione cellulare e lettura fluorescente

NOTA: il lettore di piastre a fluorescenza con un sistema di pipettaggio automatizzato consente il trasferimento automatico di composti da una sorgente composta alla piastra di analisi senza estrarre la piastra dal lettore di piastre.

1. Mentre le cellule vengono incubate, impostare il lettore di piastre.
   1. Impostare la temperatura su 37 °C.
   2. In Impostazioni, selezionare Flex.
   3. Impostare la modalità di lettura su Fluorescenza e Lettura inferiore.
   4. In Lunghezze d'onda impostare il numero di lunghezze d'onda su 2. Impostare l'eccitazione su 340 nm e 380 nm. Impostare l'emissione su 510 nm.
   5. Lasciate la sensibilità a Default.
   6. In Timing, impostare l'intervallo su 3.9 s. Imposta il tempo di esecuzione su 94 s per ottenere 25 letture.
   7. Quindi, selezionare il Tipo di piastra di analisi.
   8. Quindi, selezionare Wells da leggere.
   9. In Trasferimento composto (Compound Transfer), impostare Trasferimenti su 1 e Volume iniziale su 100 μL. Impostare Altezza pipetta su 100 μL, Volume su 50 μL e Punto temporale su 36 s, per aggiungere il composto alla 10a lettura.
   10. Quindi, selezionare il tipo di piastra Sorgente composta.
   11. Lasciare Triturate su Non usato.
   12. Selezionate le punte nel layout Delle punte pipetta.
   13. Per le colonne composte ea punta, assicurarsi che i composti da trasferire si trovino nella colonna 1 della piastra composta. Impostate colonna punta su 1 e colonna composta su 1.
   14. Lasciare il file Autocalibrate come ON.
   15. Fare clic su OK.
2. Quando la temperatura ha raggiunto i 37 °C, caricare le piastre nel lettore di piastre.
   1. Premere la camera di lettura per inserire la piastra di analisi nel lettoredi piastre di fluorescenza .
   2. Premere il tasto Sorgente per inserire la piastra composta. Preparare la piastra composta aggiungendo 200 μL dei rispettivi peptidi, ionomicina e glicole etilenico-bis (β-aminoetiletere)-N,N,N′,N′-soluzioni di acido tetraacetico (EGTA)-Triton X-100.
   3. Premere tip rack per inserire la casella tip. Utilizzare una punta nera per evitare l'autofluorescenza della punta.
   4. Una volta caricate le piastre, rivedere le impostazioni del software e premere Leggi.

5. Analisi dei dati

1. Determinare la concentrazione di calcio dal rapporto di fluorescenza mediante l'equazione di Grynkiewicz -
   
   dove K_d è la costante di dissociazione di Fura-2 AM, R è il rapporto di emissione dopo eccitazione a 340 nm e 380 nm (F340/F380) per i rispettivi peptidi, R_max è il rapporto di fluorescenza massimo osservato con l'aggiunta di 50 μL di ionomicina 30 μM, R_min è la fluorescenza minima osservata con l'aggiunta di 50 μL di 100 mM EGTA/2,5%Triton X-100, e F380_min e F380_max sono l'intensità assoluta di fluorescenza di Fura-2 AM rispettivamente allo stato libero e legato al calcio.
   NOTA: La macchina eroga il liquido con una certa forza. Non impostare l'altezza di erogazione del peptide troppo vicino al fondo della piastra; può staccare le cellule. Utilizzare punte di pipette nere per evitare l'autofluorescenza. Leggi la fluorescenza massima e la fluorescenza minima per ogni piastra per ogni esperimento.

La Tabella 1 contiene le sequenze peptidiche generate attraverso il troncamento degli amminoacidi terminali e la scansione dell'alanina. Come mostrato nella Tabella 1,la sequenza peptidica RKKWNKWALSR manca di fenilalanina N-terminale (F) rispetto al suo genitore PAMP-12 e quindi è un peptide rappresentativo nella libreria N-troncata. Allo stesso modo, in FRKKWNKWALS, la serina C-terminale PAMP-12 è stata rimossa, rappresentando una libreria peptidica C-troncata derivata da PAMP-12. Nella libreria peptidica N+C-troncata, l'amminoacido sia da N che da C-terminale viene rimosso. Il troncamento di 4 amminoacidi da N-terminale e 1 residuo da C-terminale di PAMP-12 si traduce in WNKWALS. La libreria peptidica derivata dalla scansione dell'alanina ha un amminoacido sostituito con l'alanina, come con ARKKWNKWALSR, dove la fenilalanina N-terminale viene sostituita con l'alanina. Il colorante Fura-2 AM è stato utilizzato per studiare il potenziale di attivazione dei peptidi contro le cellule HEK trasfettate MRGPRX21. I dati sono stati registrati su un lettore di lastre a fluorescenza. Se il ligando peptidico attiva la cellula, la fluorescenza pompata a 340 nm (F340) aumenta, mentre la stessa diminuisce per la lunghezza d'onda di 380 nm (F380) (Figura 1a). Per un bianco (o per quella materia un peptide non attivante o un controllo HEK-WT) tuttavia, l'aumento e la diminuzione relativi sarebbero rispettivamente bassi, come mostrato nella Figura 2a. La concentrazione di calcio è, tuttavia, rappresentata dal rapporto F340/F380 come mostrato nella Figura 1b,2b. Il rapporto F340/F380 può essere ulteriormente sostituito nell'equazione di Grynkiewicz per ottenere la concentrazione di calcio utilizzando calibrazioni in situ (Figura 3). I peptidi elencati nella Tabella 1 sono stati caratterizzati da spettroscopia di massa (Figura 4a) e HPLC (Figura 4b) e sono risultati di elevata purezza.

Tabella 1: Sequenze peptidiche rappresentative generate dopo N, C e N + C - troncamento e scansione dell'alanina. L'N-terminale dei peptidi era acetil modificato mentre il C-Terminale conteneva un gruppo ammido.

Figura 1: Dati rappresentativi per un peptide attivante. ( a ) I segnalidifluorescenza per un peptide attivante. I dati rappresentati corrispondono a PAMP-12 (FRKKWNKWALSR). Il peptide è stato aggiunto dopo aver generato una linea di base per 10 cicli di lettura (36 s), come mostrato dalla freccia. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Dati rappresentativi per lo spazio vuoto. (a) I segnali di fluorescenza per il Blank. HTB è stato aggiunto dopo aver generato una linea di base per 10 cicli di lettura (36 s), come mostrato dalla freccia. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Dati rappresentativi per gli standard per la taratura del colorante. (a) La ionomicina è stata aggiunta alla 10a lettura, come mostrato dalla freccia, per ottenere la massima fluorescenza nello stato legato Ca+ 2. EGTA-Triton X-100 è stato aggiunto dopo 20 letture, come mostrato dalla freccia, per ottenere un segnale minimo. b) Il rapporto tra l'emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 340 nm (F340) e quella di emissione di fluorescenza dopo eccitazione a 380 nm (F380) (F340/F380). Questi valori sono ulteriormente inseriti nell'equazione di Grynkiewicz per ottenere la concentrazione intracellulare di calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratterizzazione di un peptide rappresentativo per confermare la sequenza e la purezza. (a) La massa teorica della sequenza peptidica rappresentativa WNKWAL era 857,90 Da, che è stata mostrata dal rapporto m/z nella spettroscopia di massa. b)Purezza del peptide del 99% come confermato dall'HPLC. Questo peptide appartiene alla libreria peptidica N+C-troncata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.