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Tutti gli esperimenti che utilizzano hPSC sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati condotti in una cappa di biosicurezza di Classe II con adeguati dispositivi di protezione individuale. Tutti i reagenti sono di grado di coltura cellulare, salvo diversa indicazione. Tutte le colture vengono incubate a 37 °C, 5% CO2 atmosfera atmosferica. In tutte le fasi del test, i corpi embrioidi o gli organoidi renali possono essere raccolti e fissati o preparati per l'analisi. Le linee hPSC utilizzate per generare questi dati sono state completamente caratterizzate e pubblicate18.
1. Preparazione delle tavole di coltura
NOTA: Circa 1 ora prima della scissione delle hPSC, rivestire 2 piastre di coltura tissutale da 100 mm con un estratto di matrice di membrana basale qualificato (BME) di cellule staminali. Si possono pre-rivestire le piastre, sigillarle con un film di paraffina e conservare a 4 °C secondo le istruzioni del produttore.
- Preparare 2 piastre tissutali da 100 mm trattate in coltura (1 per il saggio organoide renale, 1 per mantenere la linea cellulare) e un tubo conico da 15 ml nella cappa di biosicurezza di Classe II.
- Aliquota 8 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco freddo e privo di siero in un tubo conico da 15 mL e ~ 4 mL in ciascuna delle piastre da 100 mm, sufficienti a coprire il fondo di ciascuna piastra con il mezzo.
- Estrarre dal congelatore un'aliquota di BME di 100 μL (-20 °C). Utilizzando una pipetta sierologica da 2 ml, prelevare ~ 1 mL di DMEM freddo dal tubo conico da 15 mL. Scongelare lentamente l'aliquota BME pipettando delicatamente su e giù con il DMEM freddo, evitando di produrre bolle.
NOTA: Non lasciare che l'aliquota BME rimanga a temperatura ambiente. Utilizzare immediatamente.
- Trasferire il DMEM/BME scongelato nel tubo conico da 15 ml con il DMEM rimanente. Con una pipetta sierologica da 10 ml, mescolare delicatamente il BME diluito pipettando su e giù almeno 8 volte per disperdere uniformemente il BME, evitando di creare bolle.
- Trasferire 4 mL del BME diluito in ogni piastra con DMEM e ruotare delicatamente la piastra in modo che il BME sia distribuito uniformemente. Incubare la piastra rivestita per 1 ora a temperatura ambiente o 30 minuti a 37 °C.
NOTA: utilizzare 50 μL di BME per piastra da 100 mm. L'uso di altri terreni di coltura hPSC e linee cellulari può richiedere diverse concentrazioni di BME.
2. Passaging hPSC
NOTA: per la coltura hPSC di routine, linee cellulari di passaggio con confluenza del 70-80%.
- Aspirare il terreno di coltura dalla piastra hPSC da far passare. Aggiungere ~ 8 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) alla piastra hPSC e ruotare delicatamente per lavare le cellule.
- Aspirare DBPS e aggiungere 2 ml di reagente di dissociazione a cellule gentili (GCDR) alla piastra da 100 mm, goccia a goccia sulla parte superiore per coprire le cellule.
NOTA: possono essere utilizzati anche altri reagenti di dissociazione. Regolare di conseguenza.
- Incubare a temperatura ambiente per ~ 6-8 minuti fino a quando le colonie si stanno rompendo e le cellule sono rifrattive sotto contrasto di fase (Figura 2A).
NOTA: la temporizzazione può variare tra le linee cellulari. Regolare di conseguenza.
- Durante l'incubazione, preparare un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 16 mL di mezzo hPSC (8 mL per piastra da 100 mm) e aggiungere l'inibitore della chinasi rho-associata (ROCKi) a una concentrazione finale di 5 μM.
- Aspirare DMEM dalle piastre rivestite BME e aggiungere 8 ml di mezzo hPSC più ROCKi a ciascuna piastra.
- Quando le cellule sono pronte (come descritto al punto 2.3, Figura 2A), aspirare il GCDR e inclinare la piastra di ~45° verso lo sperimentatore e raschiare le cellule con un sollevatore di cellule.
NOTA: se le celle si stanno sta staccando, omettere l'aspirazione di GCDR e procedere.
- Ruotare la piastra di ~ 90 ° e raschiare di nuovo per sollevare le celle rimanenti. Tenere la piastra ~ 45 ° e lavare le celle con 3 mL di mezzo hPSC utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
- Pipettare delicatamente su e giù per rompere grandi ciuffi (non più di 2-3 volte) e seminare le cellule al rapporto appropriato per la linea cellulare di interesse sulle piastre preparate. Posizionare la piastra con le cellule nell'incubatrice e spostare delicatamente la piastra in movimento figura otto per distribuire le cellule in modo uniforme.
NOTA: In questo esperimento le linee hPSC sono state divise in un rapporto di 1:5, questo può variare per altre linee cellulari e condizioni. Lascia il piatto indisturbato durante la notte.
- Dopo ~ 24 ore, esaminare le celle per l'attacco. Cerca piccole colonie individuali attaccate. Aspirare il mezzo esaurito e reintegrare con 8 ml di mezzo hPSC fresco (senza ROCKi aggiunto).
- Continuare a osservare e nutrire quotidianamente fino a quando le cellule raggiungono ~ 60% di confluenza per iniziare il test organoide renale (di solito raggiunto da 48 a 72 ore dopo il passaggio). Le colonie saranno idealmente discrete e non si fonderanno (Figura 2B).
NOTA: È molto importante limitare le cellule a non più dell'80% di confluenza per mantenere il loro stato di pluripotenza. Colture confluenti, manipolazione ruvida o passaggi più alti possono portare a differenziazione spontanea indesiderata o bassa efficienza della formazione di organoidi renali.
3. Giorno 0 - Impostazione del test organoide renale
- Prima di iniziare, preparare sia il mezzo E5-ILP che il supporto Stage II secondo le formulazioni (Tabella 1 e Tabella 2).
NOTA: il supporto può essere conservato per un massimo di 14 giorni a 4 °C.
- Per un saggio organoide renale (è necessaria una piastra di coltura da 100 mm per una piastra a 6 pozzetti), preparare un mezzo E5-ILP completo in un tubo conico da 50 mL: 18 mL di E5-ILP integrati con 8 μM CHIR99021 (14,4 μL), 3,3 μM ROCKi (6 μL), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo (32,7 μL).
- Posizionare 2 mL di mezzo E5-ILP completo in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a 6 pozzetti.
- Lavare le hPSC a ~60 % di confluenza (Figura 2B) due volte con ~ 8 ml di DPBS. Aspirare DPBS quindi aggiungere 2 mL di dispase per piastra da 100 mm, goccia a goccia per coprire le celle e incubare per 6 min a 37 °C.
NOTA: Dopo 6 minuti, i bordi delle colonie inizieranno ad arricciarsi (Figura 2C, frecce rosse) mentre il resto della colonia rimane attaccato. Se questo non si ottiene dopo 6 minuti, riposizionare le cellule nell'incubatore per ulteriori 30 s. Altri supporti e matrici hPSC potrebbero non essere compatibili con questa temporizzazione. Il rivestimento BME a base di laminina non è compatibile con la dispase. Se i BME a base di laminina sono la matrice hPSC standard, rivestire una delle piastre nella sezione 1 con il BME descritto in questo metodo da utilizzare per il saggio organoide renale.
- Celle di lavaggio 3x con ~10 mL di DPBS. Aspirare DPBS quindi inclinare la piastra ~ 45 ° e raschiare verso il basso con un sollevatore di celle.
NOTA: Dispase non è disattivato, quindi deve essere lavato accuratamente. Non ridurre il numero di lavaggi.
- Lavare le colonie dall'alto con 6 mL di mezzo E5-ILP completo utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Pipettare su e giù delicatamente per rompere eventuali colonie di grandi dimensioni (2 o 3 volte è di solito sufficiente).
- Distribuire uniformemente i grappoli di colonie aggiungendo 1 mL per pozzetto nella piastra a 6 pozzetti. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale (impostazioni: orbitale = 30, reciproco = 330°, vibrazione = 5° - 2 s) che viene posizionato nell'incubatore a 37 °C (Figura 2D).
NOTA: La caratteristica di vibrazione è importante per un'adeguata distribuzione degli organoidi e per evitare l'aggregazione.
4. Giorno 2 - Alimentazione con cambio mezzo-medio
NOTA: Entro le 48 ore, i cluster di colonie formeranno corpi embrioidi.
- Preparare il mezzo completo: per una piastra a 6 pozzetti preparare 12 mL di mezzo E5-ILP + 8 μM CHIR99021 in un tubo conico da 15 ml.
NOTA: Beta-mercaptoetanolo e ROCKi non sono necessari.
- Lasciare che i corpi embrioidi si depositino nella parte inferiore della piastra, inclinare la piastra ~ 45 ° quindi aspirare lentamente il mezzo dall'alto, lasciare ~ 1 mL per pozzetto.
NOTA: I corpi embrioidi in questa fase si aggregano rapidamente. Non lasciarli accontentarsi di > 5 min.
- Aggiungere 2 ml di mezzo completo preparato (sezione 4.1) per pozzetto. Riportare la piastra sullo shaker.
5. Giorno 3 - Trasferimento di corpi embrioidi al mezzo di stadio II
- Preparare un tubo conico da 50 ml e DMEM (basso contenuto di glucosio). Lascia che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del piatto. Inclinare la piastra ~ 45 ° e aspirare lentamente il mezzo dall'alto, lasciare ~ 1 mL per pozzetto.
- Raccogliere con cura tutti i corpi embrioidi da ciascun pozzo utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml e trasferirli nel tubo conico da 50 ml.
- Lavare ogni pozzetto per raccogliere eventuali corpi embrioidi rimanenti con ~ 1 mL di DMEM (basso glucosio) e aggiungerli allo stesso tubo conico da 50 ml.
- Lasciare che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo, ~ 5 min. Durante l'attesa, aggiungere 2 ml di mezzo Stage II a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Elimina grandi corpi embrioidi (>300 μm) utilizzando un filtro cellulare da 200 μm (Figura 2E).
- Utilizzare un nuovo tubo conico da 50 ml e posizionare il filtro cellulare da 200 μm sopra. Pipettare tutti i corpi embrioidi usando una pipetta sierologica da 10 ml con attenzione sopra il filtro cellulare.
- Risciacquare il colino cellulare con un ulteriore ~ 5 mL di DMEM (basso glucosio) per raccogliere eventuali corpi embrioidi bloccati nel filtro cellulare. Lasciare che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo conico.
- Quando i corpi embrioidi sono sistemati, aspirare il surnatante e lavare con ~ 10 ml di DMEM (basso contenuto di glucosio).
- Aspirare DMEM e risospendere i corpi embrioidi in 6 mL di terreno di stadio II.
- Trasferire i corpi embrioidi nella piastra di attacco ultra-bassa a 6 pozzetti, distribuendoli uniformemente tra i 6 pozzetti.
- Effettuare mezze modifiche medie come descritto nei passaggi 4.2 e 4.3 a giorni alterni.
NOTA: Dal giorno 3 in poi, i corpi embrioidi avranno un aspetto sferico "dorato" e liscio (Figura 2F). Dal ~ giorno 6, la formazione dei tubuli nei singoli corpi embrioidi diventerà evidente, con un numero crescente nei giorni successivi che raggiungerà numeri ottimali e una crescita entro il giorno 14 (Figura 2G, H) . Per eliminare la formazione occasionale di aggregazioni, osservando visivamente gli organoidi renali o corpi embrioidi molto piccoli senza tubuli, setacciare gli organoidi <200 e grandi >500 μm con filtri cellulari da 500 e 200 μm come descritto nei passaggi 5.4.1 e 5.4.2.
6. Trasferire al pallone spinner e l'alimentazione
NOTA: un pallone spinner può essere utilizzato in qualsiasi momento dal giorno 3 in poi per esperimenti che richiedono un gran numero di organoidi. Il trasferimento di routine degli organoidi avviene nel nostro laboratorio tra i giorni 6-8. Si prega di consultare la sezione Discussione per le alternative se l'attrezzatura non è disponibile.
- Trasferire i corpi embrioidi in un pallone da 125 mL con 45 mL di mezzo allo stadio II. Impostare la velocità dell'agitatore magnetico a 120 giri/min e inserirla nell'incubatore (Figura 2I).
- Per nutrire corpi embrioidi o organoidi renali, lasciare che gli organoidi renali si depositino brevemente sul fondo del pallone spinner. Sollevare il coperchio da un braccio laterale del pallone e posizionare la pipetta aspirante all'interno, con la punta che tocca la parete interna opposta.
- Inclinare lentamente la pipetta aspirante verso il basso e aspirare circa la metà del mezzo. Reintegrare con 20 ml di mezzo fresco Stage II pipettandolo attraverso la stessa apertura.
7. Impostazione della piastra magnetica a 6 pozzetti (6MSP)
NOTA: il formato 6MSP può essere utilizzato al posto dei palloni spinner se è necessario testare più condizioni. Utilizzare il 6MSP per trattamenti composti o nefrotossina. Ciò consente di risparmiare la quantità di mezzo utilizzato nella seconda fase, pur mantenendo la disponibilità di nutrienti attraverso la diffusione.
- Pulire brevemente le barre magnetiche ovali in un tubo conico da 50 ml lavando brevemente in una coltura tissutale un detergente adatto (se mai utilizzato) o immergere per > 1 ora se precedentemente utilizzato.
- Lavare brevemente 3 volte in DPBS sterile.
- Lavare 1x per 5 min in etanolo al 70%, 1x in DPBS sterile.
- Risciacquare con soluzione anti aderenza e lavare 1x in DPBS sterile e aspirare.
- Con attenzione, usando lunghe pinze sterili posizionare una barra magnetica in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti con corpi embrioidi o organoidi renali.
- Posizionare la piastra sul 6MSP e impostare la velocità su 120 rpm (Figura 2J). Mantenere gli organoidi renali con mezzo cambiamento medio come da paragrafi 4.2 e 4.3.
NOTA: affinché le barre magnetiche si inseriscano in posizione e inizino a girare, potrebbe essere necessario prima mettere brevemente il livello di potenza a 100, quindi una volta che sono tutte rotanti, portare il livello di potenza a 25.